[发明专利]一种利用EST‑SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法

摘要

本发明涉及分子标记领域，提供了一种利用EST‑SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法，该方法采用专门设计的EST‑SSR引物，以金椒的叶片基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测金椒的品种纯度进行检测，采用这种方法可以在金椒植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。

主权项

一种利用EST‑SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法,其特征在于：利用EST‑SSR引物进行鉴定，所述的EST‑SSR引物命名为ClHS1，其正向序列为5’‑AGTTTTAAGAGCAAGGAGGCTC‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为5’‑ATCCAACCCAATCCCCAGTC‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；具体步骤如下：(1)提取金椒杂交种及其亲本叶片基因组DNA；(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST‑SSR引物ClHS1进行PCR扩增：PCR反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL，0.4mM dNTPs，引物各10μM，1U Taq DNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至20μL；扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃；(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，160v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“金椒”杂交种的纯度，判定标准为：母本具有120bp、200bp、250bp、270bp特异谱带；父本具有120bp、200bp、250bp、260bp特异谱带；杂交种具有120bp、200bp、250bp、270bp、400bp、450bp特异谱带；根据上述鉴定结果，可以换算金椒品种纯度＝(1‑n/N)×100％，其中N为待测辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“金椒”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。