[发明专利]一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法

摘要

本发明涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法。本发明首先采用物理研磨配合化学酶法离散鸡肠道上皮细胞，提高了肠道细胞离散程度，缩短了细胞处理时间，保证了细胞的高活性；最佳密度细胞分离液的使用，保证了肠道上皮淋巴细胞的纯化；磁珠二抗分选法的使用，确保了目标细胞较高的纯净度；并经过细胞培养，发现本发明分离培养所得的目标细胞纯度高达90％。本发明解决了分离培养鸡肠道上皮γδT细胞过程中种种弊端，从而为鸡肠道上皮γδT细胞培养及其生物学和免疫学研究奠定基础。

主权项

一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；步骤2：制备肠壁组织浆液经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；步骤3：向细胞液加入无血清RPMI‑1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；步骤5：在浓度为1×10⁷/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI‑1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×10⁷/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。