[发明专利]一种牛巴贝斯虫LAMP检测方法

摘要

本发明提供一种牛巴贝斯虫的LAMP检测方法，通过被检标本DNA提取、设置LAMP检测试剂盒、LAMP扩增、扩增产物分析，通过被检标本出现的颜色变化与阳性对照和阴性对照比对判定。本发明提供的方法，可非常方便快速、准确地检测出被检标本中的牛巴贝斯虫，也可用于牛巴贝斯虫的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板制备步骤简单费用低，并能提高检测方法的特异性及敏感性。通过加入适量SYBR GREEN I染料即可通过肉眼观测结果，仪器要求简单，耗时短，结果判定简单，特异性和灵敏度高，可满足临床检测的需要，前景广阔。

主权项

一种牛巴贝斯虫LAMP检测方法，其特征在于，通过以下技术方案实现：(1)被检标本DNA提取：取200μl无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷‑乙二胺四乙酸溶解，4℃保存备用；(2)设置LAMP检测试剂盒：由Dof管、阳性对照、阴性对照、Bst DNA聚合酶、SYBR GREEN I染料、dNTP、甜菜碱、10×LAMP Buffer组成；(3)LAMP扩增：在Dof管中加入处理后的标本DNA，同时设阴、阳性对照，每管反应体系为：1mmol/L FIP，1mmol/L BIP，0.2mmol/L F3，0.2mmol/LB3，4mmol/L MgSO4，0.8mmol/L dNTP，0.8mmol/L betaine，10×LAMP Buffer，1μLDNA模板，加入8U Bst DNA聚合酶大片段，混匀后稍离心，置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：62℃水浴反应60分钟，接着80℃终止5分钟；(4)扩增产物分析：将扩增产物中加入1∶10稀释的SYBR GREEN I(10000×)1μL，肉眼观察颜色变化，被检标本出现的颜色变化与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为牛巴贝斯焦虫阳性或阴性。