[发明专利]一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法

摘要

本发明公开了一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法。该方法采用PCR技术：对马立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回归鸡体内一代分离株CVI988/BP1和特超强毒株648A、超强毒株G2、N以及强毒株YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059等16个毒株进行PCR扩增，并对PCR产物进行核苷酸序列的测定得到了确认。本发明所建立的方法可以对国内外广泛使用疫苗株CV1988以及814的养殖场进行肿瘤病毒检测与疾病诊断以及实验研究这些病毒株的相互鉴别。它对鸡群早期感染强毒、疾病的流行病学以及临床肿瘤病的确切诊断、环境病毒的检测和马立克氏病的预防与控制均具有十分重要的意义及应用价值。

主权项

一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法，其特征在于，采用PCR技术：对马立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回归鸡体内一代分离株CVI988/BP1和特超强毒株648A、超强毒株G2、N以及强毒株YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059等16个毒株进行PCR扩增，并对PCR产物进行核苷酸序列的测定得到了确认，具体操作步骤如下：1)设计并合成引物根据GenBank登录号为AF243438的马立克氏病病毒Md5株的序列设计合成一对引物，上游引物USF：CTAACCACAGCGTGTCTCC，下游引物USR：TGTATCTTTCCTCTGCCTTG，使用前用超纯水溶解，浓度为25pmol，置于-20℃保存备用；2)毒株的处理从液氮中取出冻存毒株：马立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回归鸡体内一代分离毒CVI988/BP1株、10个强毒分离株分别为YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入37℃水浴锅使其融化，在室温1500r/min的条件下离心5min，弃去上清，用无血清的细胞培养基DMEM 1mL重新悬浮，进行细胞基因组总DNA的提取；3)DNA的提取a.抽提液的制备，将pH8.01mol/L Tris-Cl 4μL、pH8.00.5mol/L EDTA80μL、20μg/ml胰RNA酶0.8μL、重量浓度10％SDS 20μL、20mg/mL蛋白酶K3μL和超纯水42.2μL混合均匀，得到抽提液；b.取步骤2)的各细胞培养基悬浮液250μL分别置于13个1.5mL离心管中，每管加配制好的150μL抽提液，混合均匀后置55℃水浴2小时；c.从水浴中取出消化后的样品，在每管中加入饱和苯酚400μL，充分震荡摇匀后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；d.取上步骤的上清液400μL然后加入200μL的饱和苯酚和200μL的氯仿溶液，震荡摇匀后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；e.取上步骤的上清液400μL再加入体积40μL pH5.23mol/L的乙酸钠和-20℃条件下保存的无水乙醇800μL，震荡摇匀，然后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；f.弃去上步骤的上清液，加入1mL 75％的酒精洗涤一次后，将所得核酸沉淀物放在42℃烘箱内烘干，得到DNA；g.在每管中加入20μL的超纯水，溶解DNA，获得的DNA样品置-20℃保存备用；3)PCR反应体系采用50μL的反应体系，在冰浴条件下，按下列试剂用量在16个PCR反应管中分别加入各成分：10×Buffer 5.0μL，10mM dNTP 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，各个反应管分别加入2.0μL的648A、G2、N株的基因组DNA和步骤2)各样品模板DNA，用灭菌双蒸水补足至总体积为50μL；4)PCR反应条件将PCR反应管置于PCR扩增仪中进行循环，反应循环参数：95℃预变性3min；30个循环：94℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min；72℃延伸5min，得到PCR产物；5)PCR产物的检测取8μL PCR反应产物与1μL重量浓度10％溴酚蓝染料混合，放入含溴化乙锭0.5μg/mL重量浓度为1％琼脂糖凝胶孔中，在80V电压的条件下电泳1小时后，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小，在凝胶成像系统下拍照、并记录试验结果；6)结果与判定在紫外灯下观察并于标准分子量相对照，所有毒株都只扩增出一条带，CV1988、814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059出现的片段分别是738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7)PCR产物的纯化在紫外灯下切下步骤6)判定的片段，用SIGEMA凝胶回收试剂盒进行回收；8)PCR产物的克隆将PCR产物与载体pMD18-T Vector进行连接，按常规方法将转化产物分别转化感受态细胞，挑取白色单个菌落接种至含氨苄青霉素培养基中，37℃恒温震荡增菌培养12～16h；9)对步骤8)菌液PCR鉴定a.反应体系的配制，在PCR反应管内分别加入10×Buffer 5.0μL，10mM dNTP2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，步骤8)的菌液1.0μL，用灭菌双蒸水补足至总体积为50μL；b.PCR反应条件与步骤4)相同、结果判定与步骤6)相同；10)扩增产物的序列测定与比较分析将步骤9)筛选到的阳性克隆交由广州Invitrogen有限公司和上海生物工程有限公司进行DNA序列测定，并把所测得序列在GenBank进行Blast分析，确定PCR扩增所得的核苷酸序列属于马立克氏病病毒基因组。