[发明专利]乳腺调节素，非激素依赖性乳腺癌细胞特异蛋白

说明书

本发明提供了由非激素依赖性人类乳腺癌细胞产生的乳腺调节素，它能影响激素依赖性肿瘤细胞的形态、生长和激素受体的表达，这是一种自然存在的至今尚未发现的新的因子，尤其是本发明提供了纯化形式的乳腺调节素，即至少部分清除与其自然结合的化合物，直至至少可测定部分氨基酸顺序的高纯度形式。这里介绍了乳腺调节素的生产和纯化的方法，并阐述了这一因子的发现使诊断和治疗方法成为可能。

人类乳腺癌的生长是一个复杂的过程，受控于内分泌，自分泌和旁分泌产生的激素和生长因子。乳腺癌的一个重要特征就是对于激素，尤其是雌激素的依赖性。这种激素依赖性通常随着肿瘤的发展而消失，使得激素治疗无效，而且与肿瘤侵润性增强密切相关。肿瘤一旦进入非激素依赖阶段，乳腺癌病人的预后极差。

现已发现，命名为乳腺调节素（MM）的，以前未认识到的因子是由非激素依赖性乳腺癌细胞表达的。当激素受体的表达受到抑制时，这种因子刺激侵润性较弱的激素依赖性肿瘤细胞生长加快。目前认为在肿瘤的生长进程中，在很长一段时间内，MM对于从激素依赖到非激素依赖的表型转换起到重要作用。

这一因子首次被鉴别、分离并纯化。获得基本上纯化的MM目前可用作乳腺癌的各种诊断和治疗手段。例如，可测定MM水平并用作诊断指示剂，以确定乳腺癌所处的阶段和严重程度。能够抑制MM细胞活动特性的物质，MM单克隆抗体或其它MM结合物均可以用作治疗药物来阻断MM对激素依赖细胞的刺激作用，由此可使癌症稳定，避免发展到肿瘤生长的侵润性非激素依赖阶段。此外，在治疗方面MM类似物可用来封闭激素依赖细胞的MM受体。

MM是蛋白质，在10-15%梯度凝胶上对高度纯化制剂进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其表观分子量约为52-55千道尔顿。MM含有的部分氨基酸顺序为

Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr（SEQ ID No：1）

Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys（SEQ ID No：2），和

X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu（SEQ ID No：3）.

其中“X”代表未鉴定氨基酸残基。

目前认为，只要保留生物学活性，该蛋白质在总体上可以含有等位基因变异，包括残基的添加、缺失、插入或取代，变异可达全部氨基酸顺序的10%，但最好不超过5%。该蛋白质还可以含有各种翻译后修饰，例如，糖苷化作用和半胱氨酸桥的形成。

MM的另一特性是对热和酸不稳定，对胰蛋白酶和巯基乙醇敏感，而且易与其它蛋白质形成不均一的聚合体。

按照本发明实例中所介绍的方法，可以从快速生长的非激素依赖肿瘤细胞的细胞培养物提取MM并纯化成表观均一物质。获得MM的另一方法是利用氨基酸序列的信息从生产细胞系中筛选的cDNA文库，得到MM基因的cDNA，然后可将基因克隆并导入适当的载体，在适当的原核细胞或真核细胞系统中表达。

纯化的MM可以用作抗原，用常规的方法来生产多克隆或单克隆抗体。抗体，尤其是单克隆抗体可以（ⅰ）用作治疗药物来阻断MM以免刺激激素依赖细胞;（ⅱ）用于检测法中（包括生物测定、放射免疫测定（RIAs）、荧光免疫测定（FIAs）、蛋白质印迹试验和ELISAs）以检测乳房肿瘤活组织中MM的存在，由此可得到关于癌症发展阶段和预后方面的有价值的诊断信息。

纯化的MM也可用于结合试验来筛选并鉴定对MM具有亲合性的化合物，还可以用于竞争性试验来筛选并鉴定对于激素依赖细胞的MM受体具有亲合性的化合物。这些化合物可用于抑制MM的生物学活性。

此外，能抑制肿瘤细胞，尤其是乳腺癌细胞，例如非激素依赖性乳腺癌细胞中MM表达的化合物和/或对于肿瘤细胞，尤其是乳腺癌细胞，例如非激素依赖性乳房肿瘤细胞的乳腺调节素受体具有亲合性的化合物都是新药而且具有应用价值。目前已知可作为MM有效抑制剂的唯一化合物就是肝素。

实例1

从非激素依赖性细胞培养物中生产含MM条件培养基

人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长于补充了5%小牛胚胎血清的HL培养基中。按欧洲专利申请公开No.417563介绍的相同方法，制备人类白血病细胞系HL60的最佳培养基。细胞在T形培养瓶中在5%CO₂平衡气体和96%水分饱和度的条件下以粘附方式生长，倍增时间约为22-24小时。呈融合状态后用不含血清的HL培养基来替换生长培养基，在生长过程中以及在非生长融合状态时乳腺调节素（MM）释放到培养基中。