[发明专利]溶液和生物体液中多肽和蛋白质的定性定量测定方法

说明书

本发明涉及对溶液和生物体液中存在的多肽和蛋白质进行定性和定量测定的分析方法，尤其涉及到应用对多肽或蛋白质的一段氨基酸序列有专一性的抗体的一种竞争型分析测试系统，因而此多肽或蛋白或它们的某个片段可用作分析试剂。

对生物学上重要分子的分析方法必须灵敏而有专一性。至今为止，已发展了许多种测定生物体液中待测成分的方法（Levi  montalci-ni  R.et  al.，J.Exp.Zool.116：321，1951;Varon  S.et  al.，Biochem-istry  6：2202，1967;Angeletti  R.H.，Proe，Natl.Acad.Sci.USA  65：668，1970;Harper  G.P.et  al.，Nature  279：160，1979;Goldstein  L.D.et  al.，Neurochem.Res.3：175，1978;Walker  P.et  al.，Life  Sci-ence  26：195，1980;Calissano  P.et  al.，Hormonal  Prot，Peptides，Ⅻ：2，1984;意大利专利申请第47745A88号;Callegaro  et  al.，Proceed-ings  of  the  Satellite  to  the  20th  Annual  Meeting  of  the  American  Society  for  Neurochemistry，“Trophic  Facters  and  the  Nervous  System”，Colum-bus，Ohio，March  12-14，1989，Raven  Pess，Fidia  Research  Series-印刷中，Kingsbury  D.T.，Falkow  S.，“Rapid  Detection  and  Identification  of  Infectious  Agents”，Academic  Press，Levi  Montalcini  R.，Science  1237，1154，1987）。

所有这些方法都要求先获得一种或几种单克隆或多克隆抗体，或先获得可激活检测系统的待测成分。总之，无论以往还是现在都必须有相当大量的待测成分，以便通过免疫和克隆的方法获得抗体，或者用于发展标记系统。

抗原物质在生物体液中是否存在及浓度高低均可通过免疫分析技术进行测定。这项技术是根据待测抗原物质与抗体之间可形成复合物，而复合物中的一个成分可以接受标记，因而在把复合的受标记抗原或抗体与未复合的受标记抗原或抗体分离开后即可进行检测或定量分析。

在竞争型免疫分析技术中，待测液样品中的抗原物质与已知量的标记抗原共同竞争一定量的抗体结合位点。因此，与抗体结合的标记抗原与样品中的抗原在数量上成反比。与此相反，免疫测定分析用的是标记抗体，而结合到复合物中的标记抗体与样品液中的抗原物质在数量上成正比。

本方法中，为确定蛋白质分子中具有生物学意义的区段，先要确定其疏水区域和亲水区域。由于亲水区域一般都暴露在蛋白质分子的表面，因而很可能担负特定的生物功能，例如它们可能作为受体结合区域发挥作用，也可能就是抗原位点，诱导特异性抗体的产生。

本技术可用于鉴别多肽和蛋白质中与不同抗原性区域相对应的不同的疏水区域和亲水区域。例如，Hopp和Woods（（1961）Proc，Natl.Acad.Sci.USA  78：3824）提出了一个推导蛋白质分子亲水趋势的计算公式，因而能够推断多肽上某一给定肽段究竟是趋于位于蛋白结构表面还是处在结构内部。本方法着眼于长度为6-10个氨基酸残基的肽链，对单个氨基酸残基设定系数后计算其亲水值。这样沿着整个序列划分区段，每次改换一个氨基酸后进行计算，最终就得到了完整的图形（meier  R.et  al.，EMBO  J  5：1489，1986）。亲水性最强的序列对应于Hopp-Woods图上的正峰，这些峰区以外的单点正值则对应于向溶剂暴露最多的残基，而这部分分子结构即相当于主要的抗原位点，也是活性位点之所在，或者说，分子的外露区域可同其它生物大分子发生作用。

目前技术的发展要求能设计出一种灵敏而高度专一的分析方法，使多肽的蛋白，包括生物活性并不完全清楚的多肽和蛋白质的检测更为便利。这类多肽之一为神经生长因子（NGF）。