[发明专利]一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒

说明书

本申请提出一种小分子‑DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒，其中方法包括小分子化合物与所述生物素偶联修饰的转座酶A的构建；在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有所述转座酶A和镁离子的溶液进行孵育；洗脱游离的所述转座酶A后加入含有转座酶B和镁离子的溶液继续孵育；其中所述转座酶B为在所述转座酶的剪切活性靶标位点连接第二接头形成；富集切割的DNA片段并进行PCR扩增和二代测序，完成染色质DNA结合图谱测序文库的构建。各种小分子的染色质DNA结合图谱都可以通过本方法进行检测，适用性广；且成本更低，步骤更简单，文库制备时间最快只需3小时。

技术领域

本申请涉及图谱测序技术领域，尤其涉及一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒。

背景技术

与染色质DNA相互作用的小分子化合物具有重要的抗肿瘤潜力，许多染色质DNA互作分子已经作为药物在临床上广泛应用，例如Etoposide和Romidepsin (Nat Rev Genet2014, 15, 783-796.)。随着基因组结构和功能的研究越来越深入，通过小分子靶向染色质DNA或与DNA结合的相关蛋白来干预生物过程和疾病状态的策略具有广阔的发展前景。为此，在基因组水平检测小分子化合物的DNA靶标至关重要，因为小分子与染色质DNA结合位点图谱有助于解释下游的遗传学或表观遗传学机制。

蛋白质与DNA的结合位点，可以通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、靶点剪切与标签化（CUTTag）等成熟的方法检测。然而，小分子与DNA结合位点的检测则面临巨大挑战。关键难点是，小分子-DNA相互作用的解离速率常数通常较大，导致小分子在洗涤步骤中会从DNA靶点脱离。已有的几种类似ChIP-seq和CUTTag的小分子-DNA互作位点分析方法都无法高效富集靶点DNA片段，只适用于高亲和力、低解离速率的小分子，并且具有背景高、信号弱、所需细胞量大等问题。因此，许多已在临床广泛应用的靶向细胞DNA的小分子药物的具体基因组靶点无法明确，制约了药物作用机制的研究和新药研发。快速、高效检测各种小分子与染色质DNA结合位点图谱，是该领域的迫切需求。

经典的Chem-seq方法的流程如下：首先，对小分子化合物进行生物素化修饰。其次，在活细胞或者体外甲醛交联后的细胞内，加入生物素修饰的小分子进行孵育。然后，用超声波打断染色质，使小分子化合物与小片段DNA的复合体游离至溶液中。下一步，在溶液中加入表面修饰了链霉亲和素的磁珠进行孵育，捕获目标小分子化合物及其所结合的DNA片段。接着，纯化洗脱捕获下来的DNA片段。最后，制备DNA文库并进行二代测序。其中该方法耗时长，步骤复杂，同时Chem-seq方法与相关技术（Click chemistry enablespreclinical evaluation of targeted epigenetic therapies. Science 2017, 356(6345), 1397-1401）中记载的Click-seq方法信噪比低、所需细胞量大、重现性差。近期文献报道的Chem-map方法为：首先，对小分子化合物进行生物素化修饰。其次，在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入生物素修饰的小分子进行孵育。然后依次结合生物素抗体、二抗以及pA/G-Tn5转座酶；然后在加入镁离子激活Tn5酶活性后，对小分子结合位点的DNA进行剪切，同时连接测序接头。DNA片段经过PCR扩增后，进行二代测序，其整体步骤和CUTTag基本一致，但该所需细胞量仍然要10万个细胞左右，且只适用于结合力强的小分子。

发明内容

本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的目的在于提出一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒，各种小分子的染色质DNA结合图谱都可以通过本方法进行检测，适用性广；且成本更低，步骤更简单，文库制备时间最快只需3小时。

根据本申请的第一个方面提出了一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法，包括以下步骤：

(1)利用叠氮基团修饰后的小分子化合物和生物素同时修饰在转座酶的接头序列的5位形成第一接头；所述第一接头连接在所述转座酶的剪切活性靶标位点完成所述小分子化合物与所述生物素偶联修饰的转座酶A的构建；