[发明专利]检测mRNA样品加帽率的探针、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测mRNA样品加帽率的探针、试剂盒及其使用方法；试剂盒中包括探针，具体探针设计形式为，RNA片段0‑50nt+DNA片段1‑10nt+RNA片段0‑50nt，对DNA片段上的一个或多个碱基进行硒取代；所述探针的DNA片段上未被硒代的部分受RNase H快切酶特异性切割；利用本发明的试剂盒能够检测不同长度mRNA的加帽率，结果准确稳定，保留时间及加帽率结果RSD1%。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测mRNA样品加帽率的探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

帽子结构是mRNA在体内发挥生物学功能所必不可少的元件。简单来说，mRNA帽子结构有2个最主要的功能：第一，在细胞中招募蛋白翻译机器，使得mRNA翻译表达出执行特定生物学功能的蛋白质；第二，提升mRNA稳定性，避免被细胞内的核酸内切酶降解。既然帽子结构有着如此重要的功能，那么检测mRNA加帽率毫无疑问成为mRNA生产工艺质量分析里面最关键的指标之一。

mRNA分子质量一般成百上千KDa，帽子结构只有500 Da左右。极小的帽子结构在巨大的mRNA分子面前，显得微不可辨，这就导致加帽mRNA和未加帽mRNA之间的差异极其细微，也就是一个核苷酸或者甲基的区别，常规分离分析方法难以捕捉到。mRNA加帽率检测的研究者一开始就意识到这个问题，因此，他们通过酶法降解或者切割的方式使得分子质量巨大的mRNA分子变为可分析的同位素标记单核苷酸或者5'末端短序列，比如，RNase T2，RNase H，Ribozyme等。搭配焦磷酸水解酶（TAP或者RppH），还可实现帽子方向的检测。研究者利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管凝胶电泳或者LC-MS系统区分并且定量携带帽子的短片段，从而最终确定mRNA加帽率。

RNase H 是一种核酸内切酶，能够移除DNA复制过程中片段上面的RNA引物或者加工处理R-Loops，调节R-Loops介导的生物学过程，比如基因表达，DNA复制以及DNA或者组蛋白修饰。在体外，研究报道大肠杆菌RNase H可以利用DNA-RNA嵌合结构在单链RNA特定位点进行切割。然而，RNase H切割位点存在1个或者多个，导致产生的5'末端短切割片段是异质化的，相互之间存在1个或者几个核苷酸的差异。

而液相色谱质谱法可以将不同样本流出物的组成和含量变化转变为质谱信号，通过质谱仪器测定，从而实现定性定量，以此来表征mRNA的产品纯度和完整性。但是该方法对样本量要求很高，且容易产生离子加和峰，同时液相色谱质谱法对mRNA检测还存在结果不稳定的现象，体现为色谱峰保留时间不重复和加帽率结果变化较大。

发明内容

为了解决现有技术的不足，解决现有液相色谱质谱法容易产生离子加和峰，且对RNase H快切酶切割得到的mRNA片段进行加帽率检测结果不稳定，样品消耗大的问题，本发明公开了以下方案：

本发明第一个方面公开一种定制化探针，具体定制化探针设计形式为，RNA片段0-50nt+DNA片段1-10nt+RNA片段0-50nt，对DNA片段上的一个或多个碱基进行硒取代；硒取代具体是指脱氧核酸上磷酸根中的氧原子被硒原子取代。定制化探针与待测mRNA的5’端的特异区段反向互补；所述定制化探针的DNA片段上未被硒代的部分受RNase H快切酶特异性切割。

优选地，所述探针设计形式为RNA片段0-50nt+DNA片段2-10nt+RNA片段0-50nt。

其中DNA片段还可以选自3、4、5、6、7、8、9nt中的任一长度。

优选地，所述定制化探针设计形式为，RNA片段10nt+DNA片段6nt+RNA片段10nt，对DNA片段上的一个或多个碱基进行硒取代。

硒取代后，酶切的可能性降低，会导致酶切更倾向于在只有第四位未取代的DNA处，即提高了酶切特异性。这类设计，可以使之前只有不到50%的酶切特异性提升至90%以上。