[发明专利]一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法

说明书

本发明提供了一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法，属于微生物技术领域。包括将土壤样品与PBS缓冲液混合、振荡，得到土壤菌悬液；将土壤菌悬液与叠氮溴化丙锭溶液混合、暗孵育，得到暗孵育物等步骤。将PMA核酸染料应用于复杂土壤样品活性微生物群筛选的实验步骤具体化；暗孵育和曝光反应过程中充分振荡PMA‑土壤溶液，避免局部土壤黏连导致PMA无法充分接触死细胞DNA或局部染料过多破坏活性微生物细胞；PMA‑Lite^TM LED光解仪曝光时温度一直维持在37℃以下，避免了光解时温度过高对活性细胞造成的损伤。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法。

背景技术

活性微生物是指具有或潜在具有生长代谢特性和适应改变既定环境能力的微生物(Emerson et al.,2017)，也是土壤微生物生态学中微生物分离培养或功能鉴定的主要目标。然而，尽管高通量测序技术已成为研究土壤微生物多样性及其群落结构的重要工具(Rinke et al.,2013)，但基于非选择性鉴定活性微生物的土壤总DNA扩增测序无法反映出土壤中真实的活性微生物群，且很可能高估了土壤中活性微生物的种类和数量(Dlott etal.,2015)。这是因为，土壤微生物总DNA主要包括：1)活细胞DNA，具有代谢活性且可培养的完整细胞(Nocker et al.,2009)；2)休眠细胞DNA，低代谢活性且不可培养的活细胞和抗生素持留菌细胞，但在一定条件下可恢复其代谢活性和可培养性的完整细胞(Ayrapetyan etal.,2018)；3)死细胞DNA，包括细胞膜受损且正在裂解的和已死亡的非完整细胞(Nebe-von-Caron et al.,2000)；4)胞外DNA，包括游离DNA和吸附于土壤颗粒上的DNA(Levy-Booth et al.,2007)。因此，如何准确鉴定并量化土壤中的活性微生物群，是当前土壤微生物生态学研究中亟待解决的关键问题。

细胞膜的完整性作为微生物活性的判断标准为许多研究者所接受(Grégori etal.,2001；Emerson et al.,2017)。基于细胞膜完整性的活性微生物筛选方法中，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是最早被广泛用于活菌筛选的核酸染料(Williams et al.,1998)，它只能穿透受损的细胞膜并在嵌入双链DNA后释放红色荧光，通常结合荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜或流式细胞仪进行活性细胞检测(Nicoletti et al.,1991；Pietkiewicz et al.,2015)。但是，PI染料的应用也存在一些限制和弊端，它会将某些正在生长的活性细胞染色，如Sphingomonas sp.(Shi et al.,2007)，此外，使用PI染料处理后的样品不能够应用于后续DNA扩增测序中，即PI染料不适用于复杂环境样品中活性微生物群落结构的研究。Nogva等(2003)和Nocker等(2006)先后提出了EMA(Ethidium MonoazideBromide)/PMA(Propidium Monoazide)核酸染料可用于筛选活性微生物，与PI类似，EMA/PMA染料被阻隔在活菌的完整细胞膜之外，而与胞外DNA和膜受损的非活性细胞DNA不可逆共价结合，最后阻断其DNA分子的PCR扩增反应。由于结合EMA/PMA染料的DNA分子被永久修饰，筛选出的活性微生物可用于后续DNA测序等多组学研究，使得该方法得到了广泛应用(Elizaquível et al.,2013；Emerson et al.,2017)。然而，EMA染料在随后的多数实验中被发现具有一定细胞毒性，会结合Mycobacterium avium等某些活菌DNA(Nocker et al.,2006)，这是因为具有一个正电荷的EMA(PMA具有两个正电荷)更易穿透活菌细胞膜(Fittipaldi et al.,2012)，导致实验出现假阴性结果，使得PMA在选择性筛选活性微生物方面更具优势。