[发明专利]PCV2 ORF4 30-49aa或30-39aa在研发或制备抗PCV2药物中的应用

说明书

本发明公开了PCV2ORF4 30‑49aa或30‑39aa在研发或制备抗PCV2药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明以IPEC为模型探究PCV2引起肠道TGF‑β表达增多的关键氨基酸位点，以及其是否引起T细胞中Treg亚群的变化。以病毒为出发点，构建了PCV2的6种已知会在复制过程转录蛋白的ORFs质粒，将其分别进行转染，为探究病毒的不同蛋白是否有诱导表达TGF‑β的功能。结果表明引起IPEC大量表达TGF‑β的关键氨基酸位点为ORF4的30‑49aa，进一步确定为ORF4的30‑39aa。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及PCV2 ORF430-49aa或30-39aa在研发或制备抗PCV2药物中的应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)于1998年被发现，为猪圆环病毒病(PCVD)的病原因子，严重影响全球养猪业。与PCV2相关的疾病综合征最先被描述为断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)。随着越来越多的疾病如生殖障碍、肠道疾病和呼吸道症状与PCV2感染有关，被重新命名为猪圆环病毒病(PCVD)。PCV2的复制严重依赖于宿主细胞机制。在病毒复制过程中，PCV2与多种宿主细胞因子相互作用，调节宿主免疫功能，导致细胞因子失衡、免疫抑制和腹泻等疾病。

该病毒被预测含有11个开放阅读框，其中6个已经被鉴定能够编码该病毒的蛋白。ORF1基因能够表达Rep蛋白，目前，Rep蛋白被认为是PCV2的一个很重要的免疫原性蛋白。PCV2的ORF2所编码的蛋白是PCV2的衣壳蛋白(Cap)。ORF3蛋白主要分布于细胞核，可以有效介导细胞凋亡(如PK15、PBMC和淋巴细胞等)。PCV2ORF4可以抑制caspase-3和caspase-8的活性，且可以通过调节CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞而影响宿主的免疫系统。已有研究证实了ORF5可能通过调节NF-kB的信号通路来维持PCV2的持续感染，且起到了重要作用。ORF6基因对IL-12有一定的影响，单独表达ORF6能显著上调IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13等细胞因子表达。此外，接种PCV2的肺泡巨噬细胞(PAM)产生大量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素8(IL-8)，以及引起中性粒细胞趋化因子-II、粒细胞集落刺激因子和单核细胞趋化蛋白-1水平的上调。因此，PCV2感染后引起的细胞因子变化以及其免疫抑制疾病一直是关注的热点。

已有研究表明，PCV2感染IPEC后可通过诱导IPEC大量表达TGF-β及IL-6从而促进CD4⁺T细胞向Treg分化。而HIV作为公认的免疫抑制性疾病，在已有的研究中表明，HIV感染患者体内同样会过度表达TGF-β在体内感染后，T细胞早期会出现增殖性缺陷。

而自身反应性T细胞的抑制依赖于调节性细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)和调节性T细胞(Treg)。转化生长因子β(TGF-β)通过诱导Foxp3的表达抑制T细胞克隆性缺失和外周Treg细胞的分化。Treg细胞在T细胞抗原受体(TCR)和细胞因子信号的响应下进一步分化为完全抑制效应的Treg细胞。PTreg细胞主要存在于肠道，主要是由TGF-β的大量表达，在黏膜部位对共生细菌的耐受性特别重要。因此，已被证实猪肠道感染PCV2引起TGF-β表达增多从而发挥对T细胞增值的抑制，进而产生免疫抑制作用，是PCV2感染肠道后引起免疫抑制作用研究的重要基础。

已知PCV2会引起IPEC大量表达TGF-β，尝试从PCV2结构蛋白展开探究，研究其感染肠道上皮细胞后诱导TGF-β大量表达的作用位点，进一步探究其对Treg亚群的影响，解析PCV2对Treg细胞分化成熟的关键调控作用，利用基因截短技术和真核质粒重组，从PCV2蛋白表位影响TGF-β产生角度，借助肠上皮细胞对Treg细胞分化的影响，以完善PCV2感染仔猪免疫抑制机制及该病免疫防控和免疫治疗奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供猪圆环病毒2型ORF430-49aa在筛选抗猪圆环病毒2型药物中的应用。