[发明专利]一种与PD-1抗体疗效相关的生物标志物及其应用

权利要求书

1.检测尿刊酸的试剂在制备用于评价或预测肿瘤患者对PD-1抗体疗法有效性的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为结直肠癌、胃癌、肺癌。

3.尿刊酸在制备用于评价或预测肿瘤患者对PD-1抗体疗法有效性的试剂或试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为结直肠癌、胃癌、肺癌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：方法具体为：收集肿瘤患者的生物样本，对生物样本进行预处理获得进样样品，采用LC-MS/MS分析方法，基于尿刊酸标准曲线获得生物样本中尿刊酸的含量，将尿刊酸的含量与肿瘤患者对免疫疗法有效性评价指标进行相关性分析，根据肿瘤患者尿刊酸的含量高低预测肿瘤患者对免疫疗法有效性。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的生物样本为肿瘤患者的粪便、血清；

生物样本的预处理为：

步骤a、取-80℃保存的粪便，称取50mg粪便，按照粪便与超纯水的质量比为1:4加入超纯水，加入锆珠，使用组织研磨仪，在0～4℃下匀浆，得到粪便匀浆液；取-80℃保存的血清，冰上融化；其中，使用组织研磨仪研磨振荡4次，每次1min；

步骤b、粪便匀浆4℃、18000rpm离心10min，取100μL上清液或融化后的血清，加入400μL含500ng/mL 1-甲基色氨酸的甲醇，2000rpm涡旋5min，4℃离心两次，每次18000rpm离心10min，得到粪便样品上清液或血清样品上清液；

步骤c、取350μL粪便样品上清液或血清样品上清液，挥干；100μL 50％甲醇，涡旋1～2min复溶，4℃、18000rpm、离心10min，获得进样样品。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：尿刊酸标准曲线的建立：称取10mg尿刊酸标准品，DMSO溶解配制为浓度为10mg/mL的储存液，再以甲醇为溶剂，配制一系列浓度尿刊酸标准曲线工作液，吸取100μL上清液，加入400μL含500ng/mL1-甲基色氨酸的甲醇，2000rpm涡旋5min，4℃离心两次，每次18000rpm离心10min，得到上清液；取350μL上清液，挥干；100μL 50％甲醇复溶，涡旋1～2min复溶，4℃、18000rpm、离心10min，取上清液进行LC-MS/MS分析，测得尿刊酸的浓度，以尿刊酸的浓度为横坐标、以尿刊酸的检测离子对的响应峰面积和1-甲基色氨酸的检测离子对的峰面积之比为纵坐标，建立尿刊酸标准曲线。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：液相色谱检测条件：色谱柱为EclipsePlus C18柱，长150mm，直径为4.6mm，填充粒径为5μm；柱温为40℃，进样体积为5μL，色谱柱流速为0.6mL/min，流动相A为含0.1％甲酸的超纯水，流动相B乙腈；梯度洗脱程序：0-2min：1％流动相B；2-6min：40％流动相B；6-9min：90％流动相B；9-14.5min：1％流动相B；

质谱检测条件：正离子检测模式；尿刊酸的检测离子对为138.8/120.9；1-甲基色氨酸的检测离子对为219.200/160.000。