[发明专利]一种细胞内活的不可培养细菌的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种细胞内活的活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.从宿主细胞内分离出细菌样品，用缓冲液洗涤细菌样品后，加入缓冲液重悬，得到细菌样品悬液；

S2.将荧光染料SYTO9和PI分别加入二甲基亚砜中，再用缓冲液稀释得到SYTO9染色工作液和PI染色工作液，将其避光置于-20～4℃冰箱中保存备用；

S3.将SYTO9染色工作液和PI染色工作液分别加入步骤S1的细菌样品悬液中，用涡旋仪离心使其混合均匀，在室温条件下避光孵育，得到染色细菌悬液；

S4.用缓冲液稀释调节染色细菌悬液的浓度，采用流式细胞仪检测染色细菌悬液中的活的不可培养细菌的含量，在最大激发波长和发射波长下可检测绿色荧光和红色荧光的细菌，其中红色荧光为死的细菌，绿色荧光为活的细菌；

S5.流式细胞仪检测参数设置首先画出FSC/SSC的散点图、双参数FITC-A/PI-A散点图，其中FITC通道收集SYTO9的绿色荧光，PI通道收集PI的红色荧光，根据其信号调节光电倍增管电压，在散点图中圈出所要分析的细菌，再根据不同荧光结合不同状态的细菌画出十字门，收集信号，分别为Q1、Q2区、Q3和Q4区，当Q4区出有信号响应，表明细菌进入活的不可培养状态；所述Q1区为死的细菌、Q2区为受损伤的细菌，Q3区为未染上色的细菌，Q4区为活的细菌。

2.根据权利要求1所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，步骤S1、S2和S4中所述缓冲液均为0.01～1mol/L无菌磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，步骤S1中所述细菌样品为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌中的一种以上。

4.根据权利要求1所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，步骤S2中所述SYTO9染色工作液和PI染色工作液的浓度均为1～100μmol/L。

5.根据权利要求1所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述待测样品与SYTO9染色工作液或PI染色工作液的体积比均为(0.1～1)mL:(1～100)μL。

6.根据权利要求1所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述孵育的时间为5～30min；所述细菌悬液的浓度为10⁵～10⁷CFU/mL。

7.根据权利要求1所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法，其特征在于，步骤S4中所述绿色荧光的最大激发波长和发射波长为480和500m；红色荧光的最大激发波长和发射波长分别为490和635m。

8.根据权利要求1-7任一项所述的细胞内活的不可培养细菌的检测方法在检测临床中的应用。