[发明专利]一种通过血样检测判断动物体内存在移植物的方法

权利要求书

1.一种通过检测循环中的微量核酸验证动物体内移植物是否存活的方法，所述方法包括：a)从受移植生物体内抽取血样；b)通过核酸检测法检测所述血样中是否有移植物的特有基因的存在；c)通过所述血样中存在所述移植物特有基因的事实判断所述移植物是否存在于所述动物体内：若检测到所述移植物特有基因，则判断为该动物体内存在所述移植物；其中，所述动物体内移植物选自通过下组的一项或多项的移植物：脑移植、静脉注射移植、经鼻滴入移植、局部组织/器官/空腔注射移植、局部包埋/贴片移植。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸检测法的步骤为：

-核酸扩增步骤：使用靶向移植物的特有基因的引物进行PCR反应扩增来自所述血样中的移植物核酸；

-催化/显色步骤：使用sgRNA与Cas12b和荧光探针检测血浆中是否存在来自移植物的特有基因的序列片段，其中，在sgRNA结合靶核酸的情况下所述Cas12b会反式切割荧光探针从而显示荧光，基于荧光检测的结果来确认所述血样中是否有移植物的特有基因的存在。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述移植物和受移植生物体都是哺乳动物来源的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述移植物是人来源的，而受移植生物体是小鼠；所述特有基因为TBC1D8B、ADH1C(A)或者BCL11A。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述移植物和受移植生物体均是人来源的，所述特有基因为移植物供者和受移植生物体的差异基因位点，所述特有基因优选为组织相容性复合体(MHC)基因中的白细胞表面抗原(HLA)位点。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，当所述基因是TBC1D8B时，所述F端引物选自SEQID NO.1、3、5、8、11中的任一项，最优选为SEQ ID NO.1；而R端引物选自SEQ ID NO.2、4、6、7、9、10中的任一项，最优选为SEQ ID NO.9。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，当所述基因是TBC1D8B时，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.13-17的任一项，最优选为SEQ ID NO.17。

8.根据权利要求4或5所述的方法，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.18号所示，具体为5'-FAM-TTTTTTT-BHQ1-3'。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述F端引物选自SEQ ID NO.23、27、30、34、38中的任一项；而R端引物选自SEQ ID NO.24、28、31、35、39中的任一项。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.22、25、26、29、32、33、36、37中的任一项。

11.根据权利要求3所述的方法，其中，在扩增步骤使用等温扩增反应，孵育时间为至少15分钟，温度为37至50℃。

12.根据权利要求3所述的方法，其中，在催化/显色步骤所使用的反应时间为至少25分钟，Cas酶浓度为20至200nM，荧光探针的初始浓度为150至1000nM。