[发明专利]多能干细胞衍生内皮细胞外泌体的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种多能干细胞衍生内皮细胞外泌体hiPSC‑EC‑Exo的制备方法，包括步骤：建立体外hiPSC‑ECs分化体系后通过分步离心提取上清液中的外泌体。本发明还公开了多能干细胞衍生内皮细胞外泌体hiPSC‑EC‑Exo在制备治疗或预防缺血性心脏病的干细胞衍生产品中的应用。本发明的hiPSC‑EC‑Exo制备方法，能高效分离提取hiPSC‑EC‑Exo，并首次证明hiPSC‑EC‑Exo心肌注射可显著改善心梗小鼠的心肌收缩功能、血流动力学，还可减轻心梗后有害的左室重构，具有治疗缺血性心脏病的作用，可作为细胞治疗的替代方法，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医药、医学保健领域，涉及一种外泌体，具体涉及一种人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生内皮细胞(hiPSC-ECs)外泌体(hiPSC-EC-Exo)的制备方法及其在治疗心梗中的应用。

背景技术

心血管疾病是全球的头号死因，而其中的心肌梗死由于发病率和死亡率不断上升，已经成为严重危害我国居民健康的疾病之一，并且给社会带来了沉重的经济负担。因此，急需发展安全有效的心肌梗死治疗手段。干细胞治疗，例如多能干细胞衍生内皮细胞(hiPSC-ECs)，被看作一种修复梗死心肌的潜在方法。有研究表明，hiPSC-ECs具有促进血管新生和减少心肌细胞凋亡来保护缺血性心肌的疗效。然而，较低的细胞移植效率和存活率限制了hiPSC-ECs的治疗前景，并提示旁分泌作用可能是干细胞发挥作用的主要机制。

外泌体是一种直径在30-150nm之间具有脂质双分子层结构的碗碟状囊泡，被看作是移植细胞旁分泌作用分泌所释放的重要可溶性因子。外泌体作为一种治疗性载体，其中存在丰富的多功能蛋白、磷脂、和核酸(包括mRNA和microRNA)，这也是外泌体行使多种生物功能如免疫调节，肿瘤的生长与迁移，血管新生，组织损伤修复尤其是心肌修复的重要媒介。与干细胞移植治疗心梗相比，外泌体作为一种脱细胞疗法存在着能够避免移植细胞引起的异常分化、同时减少宿主的免疫排斥反应、增加修复梗死心肌效率等诸多优点。因而脱细胞的外泌体疗法有望成为促进梗死心肌修复的新策略，但hiPSC-EC分泌的外泌体是否也具有保护缺血心肌的疗效未知。

钙离子作为细胞内一种独一无二的第二信使，在多种生物途径中都发挥着重要作用，例如肌肉收缩，能量代谢和细胞凋亡。Ca²⁺稳态的紊乱是心脏衰竭的一个重要标志，因为心肌细胞收缩功能依赖于细胞内Ca²⁺循环的同步运动，这有助于心律的产生和兴奋-收缩耦合。大量的证据表明心肌梗死会导致Ca²⁺循环的紊乱。进一步的，细胞内过高的钙离子浓度会进一步影响细胞的能量代谢，因为过高的钙离子水平需要被线粒体所摄取从而增加了线粒体的负担，这种能量供给和利用的平衡的打破进一步导致了凋亡信号通路的激活；同时细胞内过高的钙离子浓度会进一步激活钙依赖水解酶的激活，这种钙依赖水解酶的过度磷酸化则会导致心肌肌丝的降解，影响收缩功能同时激活凋亡信号通路。因此，通过维持细胞内钙稳态来减轻心肌的缺血性损伤就显得尤为重要。hiPSC-EC-Exo能否通过调控钙稳态来起缺血心肌保护作用有待研究。

探究hiPSC-EC-Exo是否可以作为一种新型的修复梗死心肌策略将变得十分有趣。但是目前的研究存在着重大的不足：1)如何建立高效的提取hiPSC-EC-Exo体系；2)hiPSC-EC-Exo是否在体内、体外对缺血心肌具有保护作用；3)hiPSC-EC-Exo是否能通过对钙稳态的调控从而发挥对缺血心肌发挥保护作用。回答这些问题将有助于开发一种可以高效提取且在治疗心梗疾病具有优秀应用价值的干细胞衍生产品。

发明内容

本发明要解决目前缺乏高效的多能干细胞衍生内皮细胞外泌体(hiPSC-EC-Exo)的制备方法的技术问题，提供一种多能干细胞衍生内皮细胞外泌体(hiPSC-EC-Exo)的制备方法，该方法可高效分离提取hiPSC-EC-Exo，并进一步确定hiPSC-EC-Exo对心梗后缺血心肌具有治疗保护作用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: