[发明专利]多靶标的群体感应淬灭酶制剂及其制备方法与应用

说明书

本发明属于群体感应淬灭酶制剂技术领域，具体涉及多靶标的群体感应淬灭酶制剂及其制备方法与应用，如主要用于对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制，则包括酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO蛋白和3‑羟基‑4‑氧代喹诺酮2，4‑双加氧酶AqdC蛋白，两者的质量比为20：(1‑25)；如主要用于对铜绿假单胞菌毒力因子和生物膜合成的抑制，则还包括去铁酮，AiiO、AqdC和去铁酮的质量比为20：(1‑25)：(0.695‑2.78)，本发明能够靶向性抑制铜绿假单胞菌的Las、Rhl和PQS，制备得到的AqdC蛋白产量和稳定性均较高，两类酶调控用量后联用，有效抑制铜绿假单胞菌中不同群体感应途径所调控的毒力因子；去铁酮调控用量并与两类群体感应淬灭酶联用，能够综合有效地抑制铜绿假单胞菌毒力和生物膜。

技术领域

本发明属于群体感应淬灭酶制剂技术领域，具体涉及多靶标的群体感应淬灭酶制剂及其制备方法与应用。

背景技术

群体感应是指微生物分泌特定的信号分子并感知其浓度变化，从而对细胞密度的变化做出应答的现象。群体感应系统及分泌的信号分子能够参与调控致病菌多种毒力因子及生物膜的形成，与其毒力和致病性密切相关。目前已发现革兰氏阴性病原菌中存在多种群体感应系统，其对应的信号分子主要为酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl homoserinelactones,AHLs)、喹诺酮类(quinolones)等，不同群体感应系统和信号分子能够调控不同毒力因子。目前的群体感应淬灭酶制剂中所含的群体感应淬灭酶成分或功能单一，只能降解一类信号分子(AHLs)来抑制群体感应，无法有效抑制复杂群体感应系统和其调控的多种毒力因子；此外，病原菌致病存在着共存现象，如在细菌性呼吸道感染病灶中，往往存在着多种病原菌共存，病原菌之间存在种群内和种群间群体感应和信息交流，可能通过信号分子诱导共生菌发挥其致病性，针对病原菌中单一种类的群体感应系统进行抑制可能无法达到较好的治疗效果。

铜绿假单胞菌是引起烧创伤、免疫缺陷或肺纤维化等病人感染最主要的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌可以通过分泌多种毒力因子如绿脓菌素、绿色荧光素、胞外蛋白酶及生物膜形成等方式，引起宿主致病。如弹性蛋白酶能够引起组织损伤和炎症，促进病原体的入侵和定殖。绿脓菌素破坏宿主的防御机制，引发肺囊性纤维化疾病。绿色荧光素是铜绿假单胞菌重要的铁载体，调节毒素的分泌产生，破坏宿主的铁环境。目前，由于广谱抗生素的广泛使用以及铜绿假单胞菌极易产生耐药性，为临床上控制铜绿假单胞菌感染带来极大困难。因此，开发针对铜绿假单胞菌及其共存菌群的新型抑菌剂对临床上铜绿假单胞菌及其共存菌群感染的预防与控制具有重要意义。铜绿假单胞菌具有复杂的群体感应级联调控系统，铜绿假单胞菌的Las群体感应系统、Rhl群体感应系统分别受AHL类信号分子3-oxo-C12-HSL、C4-HSL调控，PQS群体感应系统受信号分子PQS调控，Las、Rhl群体感应系统主要调控蛋白酶、绿脓菌素等毒力因子合成，PQS群体感应系统主要调控绿色荧光素等毒力因子形成。抑制铜绿假单胞菌复杂群体感应系统是实现多种毒力因子综合抑制的有效途径。此外，由于铁是致病菌所需的重要营养物质，限制可利用的铁离子浓度也可以抑制生物膜合成，作为抗生素治疗的替代策略。

现有专利、成果中仅包含单一类别的群体感应淬灭酶，例如：

(1)成果“靶向特异性AHL内酯酶对肺部铜绿假单胞菌感染的干预研究”采用对氧磷酶降解铜绿假单胞菌信号分子3-oxo-C12-HSL，抑制该菌群体感应系统和致病性。

(2)专利“一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其药物”采用单一酰基高丝氨酸内酯酶AiiK抑制铜绿假单胞菌的生物膜、毒力因子胞外蛋白酶和绿脓菌素。

(3)专利“一种群体感应淬灭酶OLB-26及其编码基因和应用”主要提供了一种融合群体感应淬灭酶的氨基酸序列并测定了其酶活特性，该融合蛋白将两种降解不同AHL信号分子的群体感应淬灭酶AiiO和AiiA编码基因融合。

(4)中文文献“群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响”利用单一N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA作用于铜绿假单胞菌，抑制其生物膜合成、毒力因子绿脓菌素和总蛋白酶形成。

发明内容