[发明专利]一种检测牧草盲蝽对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性水平的方法

权利要求书

1.一种检测牧草盲蝽对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的方法，在药剂的诊断剂量下制作诊断玻璃管，检测牧草盲蝽田间种群及个体对药剂的抗性水平，其特征在于，所述药剂为三氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯；所述药剂的诊断剂量：三氟氯氰菊酯132.11ng/cm²、高效氯氰菊酯51.75ng/cm²。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，药剂的诊断剂量是通过不同浓度的杀虫药剂采用玻璃管药膜法对室内饲养牧草盲蝽敏感种群进行药剂毒力测定，计算LC₉₉作为药剂的诊断剂量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述牧草盲蝽敏感种群为室内饲养的未接触任何药剂的牧草盲蝽敏感种群。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，药剂的诊断剂量是通过如下步骤确定的：

(1)牧草盲蝽的室内饲养：以新鲜四季豆为饲料，进行繁殖；

(2)丙酮稀释供试杀虫药剂至不同浓度梯度作为毒力测定浓度；

(3)玻璃管药膜的制作：用步骤(2)中丙酮稀释的各梯度药剂制作毒力测定所用的玻璃管药膜，每管加入200μL各浓度药液，滚动玻璃管使药液均匀吸附在玻璃管内壁上，直至丙酮完全挥发；

(4)毒力测定：用步骤(3)中制备的玻璃管进行牧草盲蝽的毒力测定，至少进行三次生物学重复；

(5)结果及诊断剂量：对步骤(4)的结果做毒力回归曲线，并计算LC₉₉得出每个杀虫药剂的诊断剂量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所用的杀虫药剂均为90％以上的原药，并且用丙酮溶解，稀释至个浓度梯度。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中每次毒力测定实验至少做三次简单独立重复。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)用POLO-Plus软件计算结果及诊断剂量。

8.一种采用实时荧光定量PCR技术检测牧草盲蝽CYP6A13基因表达量的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)牧草盲蝽总RNA提取与质量检测：利用小型动物组织RNA提取试剂盒提取牧草盲蝽总RNA，通过超微量分光光度计和1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度及质量；

(2)反转录-PCR：利用SuperScript IV Reverse Transcriptases进行反转录；

(3)实时荧光定量PCR：根据Genbank上牧草盲蝽CYP6A13与RPL32基因的mRNA序列设计引物，CYP6A13基因上、下游特异性引物分别为：F：5’-AGAAAGATGGCTCGTCACGA-3’，R：5’-GGGTTCGGGATTGAGAGACA-3’；RPL32基因上、下游特异性引物分别为：F：5’-ACCACTCGTTTGCCATTGAC-3’，R：5’-CTGGAAACCACTAGTCCCCA-3’；

(4)以RPL32基因为内参，利用Funglyn Biotech荧光定量PCR仪(FTC-3000型号)，检测不同田间种群的牧草盲蝽CYP6A13基因的表达量，扩增体系为20uL：SYBR Green Real-timePCR Master Mix 5uL，上下游引物各0.4uL(10umol/L)，cDNA模板1uL，Nuclease-FreeWater补足到20uL。反应程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共40个循环。阴性对照用1uL Nuclease-Free H₂O代替。每个样品进行三次生物学重复，每组至少有三次技术重复；

(5)数据处理：反应得到的Ct值，采用2^-ΔΔCt法进行数据处理分析。其中ΔCt＝Ct_(CYP6A13)-Ct_(RPL32)，2^-ΔΔCt表示被测基因mRNA的表达相对于RPL32的倍数，数据统计分析采用SPSS 18.0。