[发明专利]婴童日用化学品炎症舒缓功效筛选方法用试剂盒及筛选方法

权利要求书

1.一种婴童日用化学品炎症舒缓功效筛选方法用试剂盒，其特征在于，是由以下各组分组成：

试剂盒主体A：固定液，多聚甲醛溶液，用于斑马鱼幼鱼固定，4℃储存；

检测试剂B：染色液，苏丹黑染液，用于中性粒细胞染色，4℃储存；

辅助试剂C：麻醉剂，三卡因溶液，用于麻醉斑马鱼幼鱼，4℃储存；

辅助试剂D：PBST溶液，现配现用；

辅助试剂E：脱色液，4℃储存。

2.根据权利要求1所述的婴童日用化学品炎症舒缓功效筛选方法用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主体A是浓度为1％～2％的多聚甲醛溶液；

所述检测试剂B是浓度为8～10％的苏丹黑染液；

所述辅助试剂C是浓度为0.1～0.2g/mL的三卡因溶液；

所述辅助试剂D是浓度为0.1％的PBST溶液；

所述辅助试剂E是浓度为2～4％的脱色液。

3.一种婴童日用化学品炎症舒缓功效的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

方法一：构建转基因型斑马鱼刺激模型，将发育至7～9小时的转基因斑马鱼暴露于含有婴童化妆品的胚胎培养液中，分别设置对照组、模型组和待测样品组；

各组置于恒温光控的条件下培养，各组处理相同暴露时间72小时后，对转基因斑马鱼在荧光显微镜下观察，并统计红色中性粒细胞数量，收集观察后的转基因斑马鱼幼鱼，进行RNA提取，随后进行反转录反应以及荧光定量PCR，检测炎症因子il1b和il10转录水平筛选婴童日用化学品炎症舒缓功效；

或，方法二：

构建野生型斑马鱼刺激模型，以发育至三天的野生型斑马鱼幼鱼为受试对象，分别设置对照组、野生型模型组和待测样品组；

各组置于恒温光控的条件下培养，待暴露至相同时间2天后，去除对照组、野生型模型组和待测样品组中的胚胎培养液，使用权利要求1或2所述的试剂盒，加入试剂盒主体A固定液进行固定；除去固定液，用辅助试剂D PBST溶液清洗鱼胚胎；然后用50％乙醇处理；将乙醇溶液除去，用辅助试剂E脱色液进行脱色处理；除去辅助试剂E，用检测试剂B染色液染色；将检测试剂B染色液除去，用70％乙醇溶液清洗；观察对照组、野生型模型组和待测样品组中斑马鱼幼鱼尾部中性粒细胞数量。

4.根据权利要求3所述的婴童日用化学品炎症舒缓功效的筛选方法，其特征在于，所述方法一中设置对照组：以发育至7～9小时的转基因斑马鱼胚胎为受试对象，加入胚胎培养液；

所述方法一中设置模型组：以发育至7～9小时的转基因斑马鱼胚胎为受试对象，加入浓度为0.1～0.5％的2,4-二硝基氟苯诱导斑马鱼幼鱼产生炎症刺激；

所述方法一中设置待测样品组：以发育至7～9小时的转基因斑马鱼胚胎为受试对象，加入待测样品和浓度为0.1～0.5％的2,4-二硝基氟苯的胚胎培养液。

5.根据权利要求3所述的婴童日用化学品炎症舒缓功效的筛选方法，其特征在于，所述方法一中恒温光控的条件：温度控制在28±1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为72h。

6.根据权利要求3所述的婴童日用化学品炎症舒缓功效的筛选方法，其特征在于，所述方法一中炎症因子il1b和il10以及内参ef1a的RT-PCR的引物序列如SEQ ID NO.1～6所示。

7.根据权利要求3所述的婴童日用化学品炎症舒缓功效的筛选方法，其特征在于，所述方法一中构建转基因型斑马鱼刺激模型：

选用发育至7～9小时的斑马鱼胚胎，品系为转基因中性粒细胞Lyzc:dsRED；对转基因斑马鱼胚胎进行刺激诱导：将2，4-二硝基氟苯溶液加入胚胎培养液中至其终浓度为0.1％，持续至72小时；暴露结束后在荧光显微镜下观察中性粒细胞，并使用Image J软件进行统计。