[发明专利]氢化酶的表达载体组合、重组菌、酶组合物及其应用

说明书

本发明提供了氢化酶的表达载体组合、重组菌、酶组合物及其应用，属于基因工程与酶工程技术领域。本发明通过甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲醛酶和甘油脱氢酶的联合使用，将一碳化合物还原为增值化学品甘油，通过生物酶(氢化酶SH)法实现能量辅因子NADH的快速再生和高效供给，为级联催化反应提供还原当量。在酶级联催化过程中，甲酸及甲醇对酶都有较强的抑制性，利用甲醛酶催化甲醛的缩合，可以得到中性二羟基丙酮，且反应不可逆，有效拉动了COsubgt;2/subgt;的固定。该方法指导高效二氧化碳多酶固定化系统构建，为实现二氧化碳固定及生物能源的合成提供新方法和新思路。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程技术领域，具体涉及氢化酶的表达载体组合、重组菌、酶组合物及其应用。

背景技术

化石燃料的使用，不仅导致资源和能源的短缺，而且CO₂等温室气体大量排放到大气中，导致大量环境问题。利用可再生资源如太阳能、氢能和生物质等生产能源和化学品是可持续发展的重要方向。如果能够将CO₂快速高选择性生物转化为能源或化学品，对减少温室气体排放，解决全球环境问题，实现可持续发展的社会都有重要意义。

天然酶催化剂可促进CO₂转化为各种燃料和化学品，体外多酶催化可以有效避免副反应的发生，过程效率高、专一性强，优势显著。例如利用分别来自永达氏梭菌、多食伯克霍尔德菌和酿酒酵母的甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和乙醇脱氢酶。作为催化剂进行级联反应，以NADH作为电子供体，用亚磷酸脱氢酶(PTDH)来再生辅助因子，将CO₂转化为甲醇。与传统方法相比，酶法有选择性高，收率高，反应在常温低压下即可迅速进行，能耗小等优点。

通常认为，双金属核的插入以及一个羰基和两个氰化铁配体的结合需要hypABCDEF的协同作用。HypC与HoxH的N末端区域缔合，该复合物一直维持到[NiFe]位点插入完成(参见【(参考文献：Johannes Schiffels；Thorsten Selmer.A flexible toolboxto study protein-assisted metalloenzyme assembly in vitro.[J].Biotechnologyandbioengineering.2015,Vol.112(No.11)：2360-2372.)】)。为了协调铁基团，支架蛋白HypD与第二个HypC形成复合物。将两个氰化物配体传递至Fe-HypCD，需要后者与氰化的HypE相互作用。HypE的修饰涉及与HypF的相互作用，后者在ATP依赖性步骤中从氨基甲酸酯磷酸中转移出氨基甲酸酯基团，并将其转移至HypE。而镍传递到HoxH是由HypA和HypB之间的复合物介导的，需要GTP，然后将HypC从复合物上解离。HoxW通过识别掺入的镍离子和特异性结合位点，从HoxH上裂解掉24个残基，然后在HoxY接触位点旁边将[NiFe]位内化，以提供活性。

用酶转化CO₂通常依赖于来自氧化还原当量的外部电子供应，最常见的是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。这种天然的氧化还原当量介导了两个电子和一个质子的转移，用于生物催化氧化还原转化。然而，为合成目的提供化学计量的NADH并不划算。因此辅因子的再生变得十分有意义，至今已经开发了几种辅因子再生方法，包括化学法、电化学法、光酶法。目前酶法能量辅因子如NADH的再生采用酶，速度比较慢，很难达到快速合成，这也成为制约多酶合成的一个重要因素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供氢化酶的表达载体组合、重组菌、酶组合物及其应用，本发明的氢化酶的表达载体组合表达得到的氢化酶能够用于NADH的快速再生和高效供给。

本发明提供了氢化酶的表达载体组合，包括第一表达载体和第二表达载体；

所述第一表达载体以pM1作为骨架质粒，插入有hoxW基因表达盒、hoxN1基因表达盒和hypA2B2C1D1E1F2X基因表达盒；