[发明专利]末端双茎锁式探针及其在microRNA检测中的应用

说明书

本发明公开了末端双茎锁式探针及其在microRNA检测中的应用,该锁式探针包括茎环间连接序列和分别位于茎环间连接序列5’和3’末端的茎环序列，所述茎环的部分环状区域和末端互补区域与目标待测序列互补，所述茎环间连接序列可随机设计成需要的功能序列，实现显色、靶向等功能。本发明利用在锁式探针两个末端进行茎环结构改构，结合超分支滚环扩增技术或滚环扩增技术，从而实现了检测灵敏度和特异性的双重提高，并能应用于多靶标的同时检测。本发明的探针结构设计和检测方法简单，耗时短，成本低，易于推广应用，能灵敏、特异的进行多靶标的同时检测，并可输出定性、定量的多种报告信号。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及末端双茎锁式探针，还涉及利用末端双茎锁式探针在microRNA检测中的应用。

背景技术

microRNA是一类小的非编码RNA，在人体的基因转录后调控发挥重要作用，参与很多病理生理过程，与系列疾病的发生、发展密切相关。大量研究发现在肿瘤、心血管疾病、炎症等患者的血液和体液中均有microRNA的异常表达。因此被认为是一种十分有前景的生物标志物。但是由于microRNA丰度低，通常需要进行有效的信号放大才能对其浓度进行检测。而且，单一microRNA对疾病诊疗的特异性差，通常需要多个靶标联合检测才能提供有效的临床诊疗信息，因此高灵敏度、多靶标同时检测microRNA的技术需要被开发和应用。

为了达到高灵敏度、高特异性或多靶标同时检测microRNA的目的，目前大量研究将多种分子生物学技术联合应用，或与各种检测平台相结合，从而实现灵敏度的提高或特异性的提高或多靶标的同时检测。然而，各种技术和平台的联合应用使得实验设计复杂、耗时和成本高昂，且很少有研究可以同时解决灵敏度、特异性和多靶标同时检测三个问题。

因此，亟待设计多靶标、高特异性和高灵敏度的microRNA检测分子探针，实现简单和经济的解决灵敏度、特异性和多靶标同时检测三个问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种末端双茎锁式探针，该锁式探针是对传统锁式探针两个末端进行茎环结构设计的改构，可以有效地实现灵敏度和特异性的提升，且通过超分支滚环扩增的特异性引物的不同，可以同时检测不同的microRNA分子。本发明的目的之二在于提供含有所述末端双茎锁式探针的microRNA检测试剂盒；本发明的目的之三在于提供所述末端双茎锁式探针在检测至少一个microRNA靶标中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述末端双茎锁式探针检测microRNA的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、末端双茎锁式探针，所述锁式探针包括茎环间连接序列和分别位于茎环间连接序列5’和3’末端的茎环序列，所述茎环的部分环状区域和末端互补区域与目标待测序列互补。

本发明优选的，所述茎环间连接序列长度为10～100nt；所述茎环序列的环状区域长度为3～25nt，互补区域的长度为3～15bp。

本发明优选的，所述茎环间连接序列为可随意编辑的DNA功能区域。

本发明优选的，所述功能区域富含C碱基的重复序列，转录后的富含G碱基的重复序列可折叠成G四联体DNA酶催化无色底物显色。

2、含有所述末端双茎锁式探针的microRNA检测试剂盒，包括至少一种所述末端双茎锁式探针，splint R链接酶，与所述末端双茎锁式探针的茎环区域互补的特异引物、与所述茎环间连接序列的一段碱基序列相同的通用引物、超分支滚环扩增试剂或滚环扩增试剂。

3、所述末端双茎锁式探针在检测至少一个microRNA靶标中的应用。