[发明专利]末端双茎锁式探针及其在microRNA检测中的应用

权利要求书

1.末端双茎锁式探针，其特征在于：所述锁式探针包括茎环间连接序列和分别位于茎环间连接序列5’和3’末端的茎环序列，所述茎环的部分环状区域和末端互补区域与目标待测序列互补。

2.根据权利要求1所述末端双茎锁式探针，其特征在于：所述茎环间连接序列长度为10～100nt；所述茎环序列的环状区域长度为3～25nt，互补区域的长度为3～15bp。

3.根据权利要求1末端双茎锁式探针，其特征在于：所述茎环间连接序列为可随意编辑的DNA功能区域。

4.根据权利要求2所述末端双茎锁式探针，其特征在于：所述功能区域为富含C碱基的重复序列，转录后的富含G碱基的重复序列可折叠成G四联体DNA酶催化无色底物显色。

5.含有权利要求1～4任一项所述末端双茎锁式探针的microRNA检测试剂盒，其特征在于：包括至少一种所述末端双茎锁式探针，splint R链接酶，与所述末端双茎锁式探针的茎环区域互补的特异引物、与所述茎环间连接序列的一段碱基序列相同的通用引物、超分支滚环扩增试剂或滚环扩增试剂。

6.权利要求1～4任一项所述末端双茎锁式探针在检测至少一个microRNA靶标中的应用。

7.利用权利要求1～4任一项所述末端双茎锁式探针检测microRNA的方法，其特征在于：将至少一种所述末端双茎锁式探针加入含有至少一个目标待测microRNA的溶液，在待测microRNA打开末端双茎锁式探针两端的茎环后，使用splint R链接酶将末端双茎锁式探针连接成环，然后利用连接成环的环链作为模板进行超分支滚环扩增，通过输出荧光信号检测靶标分子。或利用连接成环的环链作为模板进行滚环扩增，通过显色信号检测靶标分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述连接成环的方法如下：将末端双茎环链与待测microRNA、splint R连接酶在0.05×splintR buffer溶液中25℃共孵育1h，85℃，20min灭活，使末端双茎锁式探针有效成环。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述进行超分支滚环扩增通过输出荧光信号检测靶标分子方法如下：向成环的环链中加入特异引物、通用引物、dNTPs、DNA聚合酶、Super EvaGreen和缓冲液，使用荧光定量PCR仪在55℃进行荧光的实时监测，观察指数扩增曲线的起峰时间；

所述特异引物与末端双茎锁式探针的茎环区域互补，启动滚换扩增反应形成具有重复序列的长链；所述通用引物与茎环间连接序列的一段碱基序列相同，与滚环扩增形成的重复序列长链互补并以重复序列长链为模板进行扩增。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述滚环扩增通过显色信号检测靶标分子方法如下：在成环的环链中，加入特异引物、dNTPs、DNA聚合酶和相应缓冲体系，在30℃孵育1h后65℃灭活20min，获得具有富G序列的重复长链DNA序列，然后在反应体系中加入KCl和TE buffer，37℃孵育30min形成G四联体，随后加入hemin，37℃孵育30min形成G四联体DNA酶，再加入TMB显色底物体系，37℃孵育30min可观察到无色的TMB底物被氧化成蓝色。