[发明专利]用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系

说明书

本申请涉及用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系，涉及基因检测技术领域，其包括靶标引物探针与内参引物探针；所述靶标引物探针序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；所述内参引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9。本发明的反应体系引物探针特异性良好、灵敏度高、适用样本范围广等为快速准确检测T790M和C797S突变频率及顺反式提供了一种很好的方法。

技术领域

本申请涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系。

背景技术

表皮生长因子受体简称为EGFR，本身具有酪氨酸激酶活性，一旦与表皮生长因子(EGF)组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌的EGFR表达增高。

EGFR基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，编码跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK)活性，负责将胞外信号传递至胞内。由于EGFR的酪氨酸激酶活性，可以调节细胞的生长、增殖，分化，迁移，并且与肿瘤的发生有关。EGFR基因突变是东亚人群中非小细胞肺癌患者(NSCLC)最常见的驱动基因突变，发生率为30％_～40％。既往多项研究支持EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)单药治疗是EGFR基因突变局部晚期或转移NSCLC患者的标准治疗方案，但大多数患者会在用药后9_～14个月发生耐药，其中EGFR基因第20号外显子发生错义突变(即T790M突变)是耐药突变中最主要的类型。

第3代EGFR-TKI药物以奥希替尼(osimertinib/AZD9291)为代表，能够靶向EGFR的激活突变位点及T790M，竞争性结合EGFR-酪氨酸激酶催化区域上的ATP结合位点，阻断其信号传递。其优势在于这种结合是不可逆的，并且只能和突变的EGFR结合，而对野生型EGFR不发生作用。然而，第3代EGFR-TKI药物仍然无法逃离靶向药物耐药的宿命，患者的无进展生存期在1年左右，部分患者产生了新的耐药突变。第3代EGFR-TKI耐药机制复杂，奥希替尼的获得性耐药机制主要包括MET扩增、C797二次突变、Her2扩增、PIK3CA扩增、FGFR3、RET和NTRK基因融合等。C797S作为一种重要的奥希替尼耐药突变，其与T790M顺式(同一染色体)还是反式(不同染色体)突变，对于临床治疗策略有至关重要的影响。

微滴式数字PCR系统(ddPCR)在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含有带有目标基因突变的DNA片段，或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。根据泊松分布原理，参考阳性微滴的个数与比例即可得出所要检测的目标基因(突变)的起始拷贝数或浓度。实验结果不再依赖于Ct值，直接给出DNA的起始浓度(copies/μL)，实现真正意义上的绝对定量。实验结果判断有和无两种扩增状态不依赖于扩增效率，对PCR反应抑制物的耐受能力明显提高。反应体系微滴化可以极大的降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此特别适合在复杂背景中检测稀有突变(≥0.1％)、区分微小差异(≥1.1倍)。

相关技术中，EGFR的T790M和C797S突变及顺反式检测方法有NGS、荧光定量PCR、数字PCR方法。其中NGS方法检测灵敏度为0.2％-1％且其检测周期长、费用高；荧光定量PCR灵敏度较低，DNA用量高，在检测突变方面不如数字PCR敏感；市场上基于数字PCR法检测EGFR的T790M、C797S突变顺式、反式灵敏度为0.1％，但大多数无法计算突变频率。

针对上述中的相关技术，发明人认为，目前需要一种检测灵敏度高、检测周期短，可以准确检测出患者是否具有T790M和C797S突变及其频率，并且能定位两种突变位点的排列方式(顺式或反式)的方法。