[发明专利]用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系

权利要求书

1.一种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式的引物探针序列，其特征在于：包括靶标引物探针与内参引物探针；

所述靶标引物探针序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；所述内参引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ IDNo：9。

2.一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变且可计算突变频率的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行探针法数字PCR扩增，获得PCR扩增产物；

步骤二：检测微滴中扩增产物的荧光信号，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度；

步骤三：突变频率＝突变拷贝数/内参拷贝数*100％；

其中用于PCR扩增的体系中含有检测T790M，C797S双靶标突变的引物探针和内参引物探针，所述靶标引物探针的序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5其中T790M探针为HEX标记，C797S探针为FAM标记；所述内参的引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9；两条探针分别用FAM、HEX标记，使用时FAM：HEX＝1:1使扩增微滴与突变微滴区分。

3.根据权利要求2所述的一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变且可计算突变频率的方法，其特征在于：所述扩增条件如下：

反应体系：2×ddPCR^TM Supermix for Probes 10μL，DNA模板10ng，Primer Mix 2μL，去离子水至20μL；其中Primer Mix为浓度100um的靶标引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水13.4μL的混物1μL；浓度为100um的内参引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水14.4μL的混合物1μL；

反应条件：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s，40循环；98℃，10min。

4.一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变可判断顺反式的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行探针法数字PCR扩增，获得PCR扩增产物；

步骤二：检测微滴中扩增产物的荧光信号，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度，微滴数；

步骤三：配合使用自主研发的顺反式判读小程序，判读T790M和C797S顺反式；

其中用于PCR扩增的体系中含有检测T790M，C797S双靶标突变的引物探针，所述靶标引物探针的序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5。

5.根据权利要求4所述的一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变可判断顺反式的方法，其特征在于：所述扩增条件如下：

反应体系：2×ddPCR^TM Supermix for Probes 10μL，DNA模板10ng，Primer Mix 2μL，灭菌无核酶H2O至20μL；其中Primer Mix为浓度100um的靶标引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水13.4μL的混合物；

反应条件：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s，40循环；98℃，10min。