[发明专利]一种自体血液分离的免疫细胞在治疗疾病中的应用

说明书

本发明涉及一种自体血液分离的免疫细胞在治疗疾病中的应用。本发明提供了一种制备并扩增NK细胞的方法及由该方法获得NK细胞，验证了所述NK细胞具有较好的杀伤肿瘤能力，该NK细胞与β‑catenin单克隆抗体联用后，能够显著的抑制肿瘤在小鼠体内的生长，具有极好的治疗肿瘤效果。

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及免疫细胞领域，涉及一种自体血液分离的免疫细胞在治疗疾病中的应用。

背景技术

NK细胞于40年前被发现，主要来源于骨髓，主要存在于血液及淋巴器官中，不需要预先致敏，不依赖抗体和补体，也不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，能直接杀伤肿瘤细胞，在机体早期抗肿瘤和免疫监视中具有重要作用。在肿瘤免疫中，NK细胞属于非特异性免疫细胞，表面的标志主要有CD3，CD56，CD16等，健康人群外周血中，约占淋巴细胞总数的5％～15％，构成了机体的第一道免疫杀伤防线，通常情况处于休眠状态，信号因子激活后，会渗透到组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。

NK细胞具有杀伤细胞活化受体(killeractivato-ryreceptor，KAR)、杀伤细胞抑制受体(killerinhibi-toryreceptor，KIR)、杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin-likereceptors，KLR)和Fcγ受体(CD16)共4种受体，前3种受体可抑制或激活NK细胞，使之识别自身组织细胞与体内异常组织细胞的能力，第4种受体主要识别NK细胞表面的IgG1和IgG3标志物，介导NK细胞识别被抗体包被的靶细胞，从而发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibodyde-pendentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)，进而杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤。NK细胞具有较广的抗瘤谱，可杀伤同系、同种或异种肿瘤细胞，其杀伤靶细胞的机制可能有:①释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡。②通过死亡受体调节诱导靶细胞凋亡。③分泌多种效应性细胞因子对抗转移肿瘤。

④激发继发肿瘤免疫效应。

Wnt/β-eatenin信号转导通路异常与人类疾病有关，包括肿瘤、骨质疏松、衰老和退化障碍等。因此，对Wnt/β-eatenin信号转导通路的研究不仅有助于理解人类疾病的发生机制，而且可以为疾病的治疗提供一系列新的靶点。目前研究证实，至少有6种Wnt蛋白(Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8和Wnt8b)可以激活Wnt/β-eatenin信号转导通路。Wnt/β-eatenin信号转导通路的活化由细胞质中β-eatenin蛋白水平决定。正常情况下，细胞质中β-eatenin由泛素蛋白酶体介导呈降解状态而维持低水平表达，泛素蛋白酶体是由轴蛋白(axin)、大肠腺瘤息肉蛋白、糖原合成激酶3β和酪蛋白激酶let等组成的多蛋白复合物，包括泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。GSK-β通过磷酸化Ser3、Ser3和Thr4标记蛋白，CK1α仅通过磷酸化Ser45标记蛋白，使其被E3亚基β-转导素重复蛋白识别，介导β-catenin分子的降解，26S的蛋白酶体也随之被降解。Wnt蛋白通过与细胞表面受体复合物跨膜蛋白/共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白结合启动细胞内β-catenin的聚集。但是，目前对于Wnt蛋白结合Fz/LRP受体后引起细胞信号转导的机制还不十分清楚。多数学者认为，2者结合后，受体复合物下游蛋白即细胞质散乱蛋白被磷酸化，抑制GSK-3β和CK1α的活性，并通过固定axin蛋白，破坏多蛋白复合物的形成，最终导致非磷酸化β-catenin在细胞质中聚集，并逃脱β-TrCP的识别，避免了被降解的过程，进而转位到细胞核。在细胞核内，β-catenin与TCF形成复合物。当没有β-catenin存在时，TCF与Groucho相互作用形成复合物抑制转录活性；当β-catenin存在时，则干扰TCF与Groucho的相互作用，与TCF和其他转录辅助因子如CREB结合蛋白(CREBbindingprotein，CBP)共同启动下游靶基因的转录。