[发明专利]蚊传黄病毒属特异性qPCR检测方法

说明书

本发明公开了蚊传黄病毒属特异性qPCR检测方法，属于分子生物学和核酸检测技术领域。本发明公开了一种检测蚊传黄病毒属病毒的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。该引物组是根据12种蚊传黄病毒基因的保守区域设计获得的，对多种蚊传黄病毒基因扩增具有良好的实用价值，实现了用1对引物对12种蚊传黄病毒的同时定性检测，极大地降低了检测成本同时提高了检测通量，为蚊传黄病毒属病毒的快速高效检测提供了有效的新工具。

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，特别是涉及蚊传黄病毒属特异性qPCR检测方法。

背景技术

黄病毒科黄病毒属虫媒病毒包括黄热病病毒(yellow fever virus,YFV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、坦布苏病毒(Tembisavirus，TBV)、巴格扎病毒(Baraza virus，BGV)、以色列火鸡脑膜炎病毒(Israel turkeymeningoencephalomyelitis virus，ITV)、乌苏土病毒(Usutu virus，UVSV)、斯庞德温尼病毒(Sodwana virus，SPONV)、伊利乌斯病毒(Ileus virus，ILHV)、罗西欧病毒(Rociovirus，ROCV)等。这些病毒通过蚊子叮咬传播,引起发热、皮疹、皮肤黏膜出血、脑炎、新生儿畸形等多种疾病，其中，DENV广泛流行于全球热带和亚热带地区，特别是东南亚、西太平洋、中南美洲和非洲的100多个国家和地区；YFV主要在非洲流行,但近年来其传播范围不断扩大，亚洲已有多次输入病例报道；ZIKV主要在在非洲和南美洲流行，但东南亚已有多次暴发流行；WNV的流行范围也从北美洲扩大到亚洲、欧洲；此外，JEV主要流行于亚洲地区，但每年的感染者近7万人，其他几种病毒因未进行常规检测而鲜有报道。上述疾病的临床特征高度相似，临床治疗以对症支持治疗为主且预防控制均以防蚊灭蚊为主要措施，故即使无法或无需对上述病原体进行定种特异性检测，一种能同时对上述多种病原体进行定属通用检测的方法也将极大的有利于上述疾病的预防控制和治疗。此外，鉴于疾病预防控制的需要，各地卫生健康部门每年均需对这些疾病的病原体进行大规模监测，包括不明原因发热病人血清及媒介中病原体检测，一种能同时对上述多种病原体进行检测的方法也是提高检测通量、节约人力物力的必然需求。

现有技术中，上述病原体的检测方法主要包括病毒分离培养，酶联免疫检测及PCR检测。

病毒培养分离技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测“金标准”，但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，无法确定病原体种类，后续仍需进行PCR扩增或者测序，并且病毒分离培养操作程序复杂，对实验场地和设备有生物安全等级要求，检测耗时长，不能用于现场检测，更不能用于对大规模样品的常规监测。

酶联免疫检测是基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗体之间的特异结合，通过偶联显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗体检测由于没有信号放大的过程，灵敏度低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原变异产生的新的病毒亚型的检测能力也值得怀疑。