[发明专利]一种免标记比率荧光型检测抗原方法

说明书

本发明公开了一种免标记比率荧光型检测抗原方法。本发明包括以下步骤：设计一条单链DNA，包含对CRISPR的识别DNA序列，目标抗原的适配体，两者通过数个连续的T碱基间隔，构建出组分A；以目标抗原作为靶标，在96孔板上修饰目标抗原的抗体，构建出组分B；将表面羧基化的二氧化硅微球与末端修饰有氨基的DNA链相连，辅助DNA与有氨基的DNA互补配对形成双链，构建出组分C；将待检测物中加入组分A、组分B、组分C、铜离子和抗坏血酸、DAPI染料、核酸外切酶III；检测待检测物的红色荧光和蓝色荧光，以比率荧光法进行目标抗原检测。本发明比率荧光法比较两种荧光的强度作为信号参数，更准确、灵敏度更高、选择性更好；且提高了灵敏度、克服了传统方法需要标记抗体的缺点，节约了检测成本。

技术领域

本发明涉及抗原检测技术领域，具体为一种免标记比率荧光型检测抗原方法。

背景技术

作为免疫分析的金标准，酶联免疫检测技术（ELISA）是一种极其强大的复杂物质技术，已广泛应用于各个领域，同时也有大量的商业试剂盒可供选择。

传统ELISA主要依靠特异性抗原-抗体免疫反应，一般结合天然酶（大多数情况下为辣根过氧化物酶，HRP）催化底物作为比色信号。毫无疑问，ELISA在生物医学和其他领域检测蛋白质靶标方面性能优异。

尽管如此，传统的ELISA也存在一些缺点，例如灵敏度低、成本高、步骤耗时、繁琐。典型的ELISA检测浓度高于皮摩尔级。然而，在疾病的早期阶段，生物标志物的血清浓度范围在亚皮摩尔。弱响应可归因于比色法的固有特征和 HRP 相对较差的催化活性。此外，在抗体上标记 HRP 不仅是一个耗时而繁琐的过程，而且可能会阻碍它们的功能。致力于提高ELISA传感器的性能的方法有引入新型信号读出酶，如碱性磷酸酶 (ALP) 和纳米酶，已作为HRP的替代品应用于ELISA。尤其是，纳米酶比天然酶具有优越性（例如，可调节的催化活性、成本低和更好的稳定性），极大地提升了ELISA的分析性能。但是，纳米酶在催化反应的选择性和种类上仍然不足，主要包括氧化酶、过氧化物酶和水解酶，限制了其广泛应用。

荧光方法由于其灵敏度高于分光光度法，因此可将荧光有机染料或纳米材料代替酶标记在抗体上。此外，其他类型的功能纳米材料（如光热纳米材料）也可以标记在抗体上，进一步拓宽了ELISA的应用范围。

尽管如此，为了满足临床诊断的持续需求，必须继续开发一些高度敏感、经济且完全无标记的ELISA策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免标记比率荧光型检测抗原方法，用于提供一种免标记、比率法、灵敏度更高的检测抗原方法，以解决现有技术中灵敏度低、成本高、步骤耗时、繁琐的技术问题。

具体方案如下：

一种免标记比率荧光型检测抗原方法，包括以下步骤：

对包含有CRISPR的识别DNA序列的单链进行设计，使其包含一段目标抗原的适配体，并通过数个连续的T碱基与识别DNA序列间隔，构建出组分A；

以目标抗原作为靶标，在96孔板上修饰目标抗原的抗体，并用牛血清白蛋白来封闭非特异性结合位点，构建出组分B；

将表面羧基化的二氧化硅微球与末端修饰有氨基的DNA链相连，另一条辅助DNA与修饰有氨基的DNA链互补配对形成双链，构建出组分C；

将待检测物中加入组分A、组分B、组分C、铜离子和抗坏血酸、DAPI染料、核酸外切酶III；

检测待检测物的红色荧光和蓝色荧光，进行目标抗原检测。

进一步地，其中，检测待检测物的红色荧光和蓝色荧光，进行目标抗原检测，主要包括：

如果待检测物中存在目标抗原：

则目标抗原与组分A的适配体连接，同时目标抗原与组分B的抗体结合，则不存在单链DNA，即不存在polyT和primer DNA；

由于不存在polyT，则无法与铜离子和抗坏血酸结合发出Cu 纳米簇，红色荧光弱；