[发明专利]一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法

权利要求书

1.一种分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、获取健脾益肾方的药物活性成分；

S2、分别获取所述健脾益肾方中活性成分及上皮间质转化疾病的对应靶标，将健脾益肾方中活性成分及上皮间质转化疾病的对应靶标分别转换为对应的基因名称；

S3、将健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因在STRING平台中构建蛋白互作网络，其中蛋白相互作用的评分设置为0.9，隐藏网络中与其它基因没有关联的节点基因，然后将String_interactions.tsv文件导出，输入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化展示；

S4、将步骤S3所得健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因导入VENNY 2.1网站中绘制韦恩图；然后采用R软件对共有基因进行GO和KEGG信号通路的富集分析，结果分别以气泡图和柱状图表示；

S5、根据富集分析结果，通过与信号通路有相关联的靶标及其活性成分，构建活性成分-共有靶标-信号通路网络，系统解释健脾益肾方对上皮间质转化的作用机制并筛选核心靶点。

2.根据权利要求1所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，步骤S1具体为：采用Q-TOF/MS化学表征获取成分，并在中药系统药理数据库和分析平台、中医药整合药理学研究平台v2.0中筛选健脾益肾方中各味中药的活性成分，筛选条件为口服生物利用度≥30％且类药性≥0.18。

3.根据权利要求1所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，步骤S2具体为：在中药系统药理数据库和分析平台、中医药整合药理学研究平台v2.0、Swiss Target Prediction数据库中查询所述健脾益肾方中活性成分对应的靶标；在OMIM、GeneCards和Drugbank数据库中以epithelial–mesenchymal transition为关键词查询上皮间质转化疾病对应的靶标，通过UniProt数据库将将所有靶标转换为基因名称。

4.根据权利要求1所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，步骤S5中构建活性成分-共有靶标-信号通路网络为：将健脾益肾方中活性成分与上皮间质转化的共有基因及其相关的信号通路和活性成分导入Cytoscape 3.7.1软件中Network Analyzer插件进行网络分析，并获取网络拓扑参数，包括度中心性、接近中心性、中介中心性三者。

5.根据权利要求4所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，步骤S5中筛选核心靶点的标准为：度中心性、接近中心性、中介中心性均大于该网络平均值的靶标或活性成分节点。

6.根据权利要求1所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，还包括如下动物实验验证步骤：

S6、健脾益肾方的制备和动物分组及给药；

S7、动物造模方法

以腹腔注射10％水合氯醛麻醉动物，常规消毒铺巾，从右背部切口，打开腹腔，静脉夹夹住肾蒂后用高频电刀切除右肾上下极，切除2/3，止血后复位肾脏；2周后进行第2次手术，切除左侧肾脏，假手术组采取同样步骤打开腹腔，暴露肾脏后复位，避免牵拉肾脏；

S8、马松染色

肾脏用10％中性甲醛固定，石蜡包埋切片，采用马松染色评价肾脏病理变化；

S9、免疫印迹实验

用RIPA裂解缓冲液裂解肾脏组织，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，加载等量的裂解物并通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，室温下在5％脱脂牛奶中封闭2小时后，将PVDF膜与各种一抗在4℃孵育过夜，其中包括步骤S4富集分析的信号通路的蛋白，然后将PVDF膜在HRP偶联的二抗中室温孵育2小时，最后经过底物显色通过Tanon-6100C进行可视化。

7.根据权利要求6所述的分析健脾益肾方治疗上皮间质转化作用机制的方法，其特征在于，所述步骤S8中马松染色为脱蜡条件为在60℃的烤片机中脱蜡1小时。