[发明专利]一种抗鸡TLR15蛋白的多克隆抗体及制备方法

权利要求书

1.一种抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体由经重组质粒pET30a-chTLR15编码表达的重组蛋白经生物免疫制得，所述重组质粒pET30a-chTLR15中TLR15基因序列为SEQ ID NO.3所示，由SEQ ID NO.1核苷酸序列经密码子优化而来，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体制备方法包括以下步骤：

步骤一：鸡TLR15抗原性分析、密码子优化及基因片段的合成；

步骤二：构建原核表达载体pET30a-chTLR15；

步骤三：使用重组质粒对感受态大肠杆菌进行转化，制备工程菌；

步骤四：诱导工程菌进行重组蛋白的表达，并进行纯化；

步骤五：使用重组蛋白对家兔进行免疫，制备多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤一中鸡TLR15抗原性分析及基因片段合成方法如下：

分析NCBI上公布的chTLR15序列，选取抗原性强的片段606bp（76-681 bp），密码子优化后，两端加入EcoRⅠ、XhoI酶切位点，合成基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤二中构建重组载体的步骤如下：

用EcoRⅠ、XhoI分别酶切pET30载体和chTLR15基因合成片段，切胶回收片段，连接，获得重组质粒pET30a-chTLR15。

5.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，在步骤三制备工程菌的步骤如下：

将重组质粒pET30a-chTLR15，转化BL21感受态细胞，构建带有重组质粒的工程菌。

6.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤四中chTLR15重组蛋白表达纯化的步骤如下：

经IPTG诱导表达，去离子水洗镍柱纯化获得chTLR15重组蛋白。

7.根据权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述步骤五中制备多克隆抗体的方法如下：

chTLR15重组蛋白免疫新西兰大白兔，接种方式为背部皮下多点注射，首免使用弗氏完全佐剂，分别于第二周，第四周，第五周使用弗氏不完全佐剂进行一免，二免，三免，于加强免疫后7天取兔血清，得到抗chTLR15蛋白多克隆抗体。

8.权利要求1所述抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体在用于特异性检测鸡TLR15蛋白方面的应用；所述的多克隆抗体特异性检测指的是：抗鸡TLR15蛋白抗体识别鸡TLR15蛋白的检测。

9.一种如权利要求8所述抗鸡TLR15蛋白多克隆抗体的特异性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

蛋白样品的获得：DF-1细胞在37℃、5%CO₂培养箱内培养至70%左右，提取DF-1细胞蛋白；取鸡法氏囊与胸腺组织100mg左右，加入蛋白裂解液1mL，冷冻研磨仪研磨混匀；特异性检测：将提取的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜上，转印条件为恒流110V，85min；用快速封闭液室温封闭1h，TBST洗涤2次；β-actin（1:1000）和chTLR15多克隆抗体血清（1:1000）作为一抗，4℃过夜孵育，TBST洗涤3次，每次5min；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG（1:1000）和辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG（1:1000）作为二抗，常温孵育90min，TBST洗涤3次，每次5min；用发光液曝光，观察特异性结果。