[发明专利]一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用。该人颗粒细胞系为来源于卵巢的人颗粒细胞hGC‑YH，已于2021年12月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.45005。本发明所述的人颗粒细胞系贴壁率高、均匀度高、成活率高、稳定性强，是研究卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、女性生殖功能保护机理，及筛选促性腺激素治疗药物的良好实验材料。

技术领域

本发明属于细胞技术领域。具体涉及一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用。

背景技术

人卵巢颗粒细胞(granulosa cells，GCs)围绕于卵母细胞周围，其在不同阶段产生类固醇激素和生长因子，以旁分泌的方式调节卵泡生长发育。除此之外，卵巢GCs凋亡与卵泡闭锁密切相关。随着不孕患者日益增多，在辅助生殖治疗中，提高获取卵子的质量成为重点和难点。对卵巢GCs进行体外培养，进而对其增殖、凋亡等特点进行分析，可以为临床提高卵子质量提供新的思路。目前人们对人GCs体外培养的研究较少，GCs在体外能否进行连续传代，传代后是否保持其特性仍不确定；而且，目前尚无人颗粒细胞系的建立的报道。

因此，本发明意在提供一种可以在体外稳定传代的人卵巢颗粒细胞系。

发明内容

本发明的一个目的在于不仅能够将人颗粒细胞从卵巢中分离出来，体外进行原代培养，更能够进行传代培养，获得在体外可以稳定传代的人卵巢颗粒细胞系。

本发明的另一个目的在于提供上述来源于卵巢的人颗粒细胞系的应用为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

经过筛选，本发明获得了特性稳定、细胞均匀度高、细胞成活率高的来源于卵巢的人颗粒细胞系，该人颗粒细胞系为来源于卵巢的人颗粒细胞hGC-YH，已于2021年12月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并证明存活，其保藏编号为CGMCC No.45005，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

进一步地，本发明还提供了一种上述人颗粒细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)卵泡液的收集：收集行控制性促排卵患者穿刺取卵时的卵泡液；

(2)颗粒细胞沉淀混合物的制备：将所述卵泡液置于离心管中，离心，去上清液，沉淀物为人颗粒细胞、红细胞和白细胞的混合物；

(3)密度梯度离心法分离获取颗粒细胞：将所述颗粒细胞沉淀混合物吹打混匀后，加于3倍体积淋巴细胞分离液液面上，3000r/min离心10min，然后吸取上层白色层；加入PBS缓冲液，吹打混匀，1500r/min离心5min，去上清液，沉淀物即为人颗粒细胞；

(4)原代培养：用颗粒细胞完全培养液重悬步骤(3)获得的人颗粒细胞，在显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为2×10⁵个/ml，接种于培养皿中，置于孵箱中培养，隔天更换培养液；

(5)传代培养：当人颗粒细胞密度达到80％～90％时，弃上清，PBS洗涤，加入0.25％EDTA-胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞脱壁变圆时，用等体积颗粒细胞完全培养液终止消化，离心，PBS洗涤；弃上清后用颗粒细胞完全培养液重悬细胞，接种于培养皿，置孵箱中培养，每2-3天传一次代，体外培养到10代以后，细胞生长稳定，即获得稳定传代的人颗粒细胞系。

进一步的，上述方法中，所述颗粒细胞完全培养液是将DMEM/F12培养液89mL、胎牛血清(FBS)10mL、细胞用青链霉素(SK)1mL混合均匀制得。

第二方面，本发明还要求保护上述来源于卵巢的人颗粒细胞系在制备研究卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、女性生殖功能保护机理的细胞模型中的应用，以及在制备筛选促性腺激素治疗药物的细胞模型中的应用。