[发明专利]一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法

权利要求书

1.一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)DL油库附近石油污染土壤降解菌的筛选、富集培养：培养采用改良的基础盐培养基，其组成如下：(NH₄)₂SO₄ 2.0～3.0g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2～0.3g/L；CaCl ₂·2H₂O 0.01～0.5g/L；FeSO₄·7H₂O 0.001～0.01/L；Na₂HPO₄·12H₂O 1.5～2.0g/L；KH₂PO₄ 1.5～2.0g/L；蒸馏水1000ml；另外需要加入葡萄糖0.5～2.0g/L、胰蛋白胨0.5～3.0g/L；121℃灭菌20～40分钟；苯作为降解性微生物的诱导剂，需要0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后加入培养基中，并调整终浓度至150～200mg/L；基于相同的方式再将菌液3次转接富集培养；

(2)混合培养细菌群落结构多样性的识别：步骤(1)中培养所得的细菌群落通过16SrRNA基因作为群落结构识别的靶位点，其微生物群落组成丰度分别为肠球菌属79％±3％、不动杆菌属15％±3％、芽孢杆菌属3％±3％、克雷伯氏菌属2％等，其成员类型以兼性营养型为主；

(3)生化降解能力测定实验：用纯菌和混合菌对DL油库的石油进行降解实验，利用分光光度计和气相色谱-质谱法联合对降解前后的石油进行组分变化分析，主要分析石油组分里的正构烷烃、多环芳烃以及总石油烃含量；

(4)最优化石油污染土壤的降解体系的构建：根据单因素优化结果构建的降解系统组成成分有以下各项：取100g土，接种量10％～20％V/W；pH为6.5～7.5；牛肉膏用量0.4～0.6％W/W；

实验室自然条件下60天结束降解，在此期间，每天浇水20～30mL保持土壤含水量在20％～30％的湿润条件；

(5)降解前后土壤的宏基因组序列存在特征性：宏基因组学原始序列提交至NCBI数据库，检索号为SRX13239659、SRX13239660、SRX13239661、SRX13239662、SRX13239663、SRX13239664、SRX13239665、SRX13239666和SRX13239667；

(6)土壤宏基因组学测序及其数据分析：土壤宏基因组学分析发现对照组、单菌降解组和混菌降解组存在关键降解酶基因丰度差异，即随着污染物的浓度降低，对照组、单菌降解组和混菌降解组的加氧酶丰度依次降低，而与此相反的是脱氢酶丰度依次升高，依此理论提出构建氢供体降解系统以完成后续石油烃降解；

(7)土壤石油烃氢供体降解系统的构建：混合细菌降解结束后立刻构建氢供体降解系统；方法包括：用植物粉碎机将无氧堆肥松针土磨碎成20目的粉末，松针土的有机碳和有机质经测定分别为21.95g/kg和37.83g/kg，称取磨碎的松针土10～20g与100g土壤充分混匀；每天加入20～30mL水并搅拌均匀以保持原有微生物活性，确保脱氢酶继续发挥氧化作用。