[发明专利]一株分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明提供了一株分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明将稻瘟灵的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫(100μg/只)用完全弗氏佐剂进行乳化，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后一次用稻瘟灵完全抗原冲刺免疫(腹腔注射)。将高效价和高灵敏度小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞，并进行多次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对稻瘟灵具有较好的检测灵敏度，可以用于稻瘟灵的残留检测。

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，尤其是指一株分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

稻瘟灵的英文通用名为：Isoprothiolane，化学名称：1,3-二硫戊烷-2-叉丙二酸二异丙酯；作用机理：水稻植株吸收后，抑制磷脂N-甲基转移酶，从而使脂肪酸、甘油三醇、磷脂质的形成受阻。主要用途：该品为内吸杀菌剂，对水稻颈瘟有特效，对稻苗瘟与小球菌核病也均有效，大面积使用还可兼治稻飞虱和白背飞虱。主要用于防治水稻稻瘟病，对穗稻瘟病和叶稻瘟病都有效，对穗稻瘟病的效果更好。

目前，稻瘟灵检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简便的检测稻瘟灵残留物的方法。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测稻瘟灵的前提是得到对稻瘟灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对稻瘟灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备稻瘟灵单克隆抗体，但在制备能分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备稻瘟灵半抗原和完全抗原和如何使小鼠产生强免疫效应，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出稻瘟灵单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的稻瘟灵单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

一株分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22339的单克隆细胞株，保藏日期为2021年05月13日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备稻瘟灵半抗原及稻瘟灵完全抗原，将获得的稻瘟灵完全抗原与完全弗氏佐剂进行乳化得到免疫原1，稻瘟灵完全抗原与不完全弗氏佐剂进行乳化得到免疫原2；

(2)将步骤(1)所得免疫原1对小鼠进行首次皮下免疫，并用免疫原2进行加强免疫，将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中稻瘟灵抗体灵敏度高的小鼠，用稻瘟灵完全抗原进行冲刺免疫；

(3)将步骤(2)中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，融合后的细胞通过HAT培养基筛选培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌高灵敏度稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述稻瘟灵半抗原分子式：

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述稻瘟灵完全抗原的分子式：