[发明专利]一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用

权利要求书

1.一种高产β-丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：

（1）以E. coli W3110为出发菌，将其基因组中panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E. coli W3110/Trc-panD，记为ALA1；所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panD；将质粒pTrc99A-panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株，记为ALA2；所述外源基因panD核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示；

（3）将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc-ppc，记为ALA3；

（4）将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/△pykA，记为ALA4；

（5）将ALA4基因组中的cycA基因敲除，得到重组菌株E. coli ALA4/Δ-cycA，记为ALA6；

（6）将外源基因aspB整合入质粒pTrc99A-panD中，得到质粒pTrc99A-panDaspB；将基因aspA整合入质粒pTrc99A-panDaspB，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspA；将外源基因pyc整合入质粒pTrc99A-panDaspBaspA，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc；所述外源基因aspB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，外源基因pyc核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

（7）对panD基因进行定点突变，得到突变后质粒pTrc99A-panD^K104SaspBaspApyc，将其转入ALA6中，得到菌株ALA11，即为所述β-丙氨酸生产菌；所述panD^K104S突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。