[发明专利]一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法

权利要求书

1.一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将抗原过夜包被于免疫管，封闭后加入羊驼噬菌体天然文库结合抗原，PBST清洗未结合的噬菌体后，使用胰酶洗脱已结合的噬菌体后加入AEBSF终止洗脱，获得噬菌体洗脱文库；

(2)将步骤(1)中的噬菌体洗脱文库感染SS320进行扩增和保种细菌文库后，使用辅助噬菌体感染包装扩增噬菌体并纯化，获得噬菌体文库；

(3)用步骤(2)得到的噬菌体文库重复步骤(1)-(2)的过程2-3次，获得噬菌体洗脱文库；

(4)将步骤(3)得到的噬菌体洗脱文库感染SS320后涂板，挑取预设数量的单克隆培养，加入辅助噬菌体进行噬菌体表达，进行ELISA检测，挑取阳性孔对应的单克隆再次进行ELISA验证，保留最终的阳性单克隆；

(5)将步骤(4)最终获得的阳性单克隆进行培养、扩增、保种并测序；

(6)将步骤(5)中经测序确认无误的羊驼纳米抗体序列插入具有CAR结构的病毒核心载体中构建重组质粒，转化感受态细胞获取单克隆、保种和测序鉴定；

(7)将步骤(6)中获得的CAR重组质粒电转Jurkat细胞表达CAR后，Jurkat细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养18h，使用抗人CD69流式抗体检测Jurkat细胞的CD69表达和MFI差值；

(8)将步骤(7)中有效激活的CAR重组质粒进行病毒包装浓缩，感染Hut78细胞表达CAR后，Hut78细胞与靶细胞共培养48h，使用7-AAD流式抗体检测靶细胞的死亡率；

(9)若杀伤能力高于对照组且具有显著性差异，则判定该嵌合抗原受体CAR可用于后续实验。

2.如权利要求1所述的应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作包括：

1)将抗原包被于免疫管，包被液为CBS，pH9.6，于4℃孵育16-20h；去上清，室温下用2mlPBS清洗3次；加入2ml封闭液，室温旋转孵育2h；去上清，室温下用2ml PBS清洗3次；

2)对1)的产物离心去上清，加入2ml PBS、羊驼噬菌体天然文库0.05ml，效价大于等于10¹³pfu/ml，室温下旋转1h；去上清，用2ml PBST缓冲液室温清洗免疫管20次；去上清，加入1ml 0.25mg/ml Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；加入10μl 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的EP管中，即获得噬菌体洗脱文库。

3.如权利要求1所述的应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作包括：

1)取1.8ml菌种复苏SS320，加入2xYT进行培养至菌液的OD600＝0.250；加入步骤(3)得到的噬菌体洗脱文库500μl至2ml菌液中，37℃，220rpm，30min；将全部菌液均匀涂布到1个T150 2xYT平板中，吹干，37℃培养16-20h；取出平板，加入6ml 2×YT，刮下菌落并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，检测冻存前OD600，冻存体积为X ml＝10/OD600；

2)将细菌子文库菌液X ml加入至100ml 2×YT液体培养基中，X＝10/OD600，37℃，220rpm培养直至OD600＝0.250；加入辅助噬菌体MOI＝10：1，37℃，220rpm继续培养30min；加入终浓度为50μg/ml的Kana和终浓度为0.2mM的IPTG，30℃，220rpm过夜培养；

3)收集培养后的菌液50ml至离心管中离心2000g，10min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴30min；4℃离心2000g，20min，弃上清，纸上倒置2min；加入1mlPBS重悬沉淀至EP管，4℃离心13500g，20min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴10min；4℃离心13500g，10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀；4℃离心13500g，2min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，获得噬菌体文库。