[发明专利]一种重组工程菌及其构建方法和其应用

权利要求书

1.一种重组载体，所述重组载体含有L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、葡萄糖脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D-泛解酸内酯水解酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的重组载体。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体任选地包括第五重组载体、第六重组载体的任一种，其中，第五重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，第六重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、葡萄糖脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D-泛解酸内酯水解酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种重组工程菌，所述重组工程菌包括能够表达L-泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、表达酮泛解酸内酯还原酶的第二重组载体、表达葡萄糖脱氢酶的第三重组载体和表达D-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的任一种或其组合；

和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体；

和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶和D-泛解酸内酯水解酶的第六重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其中，所述重组工程菌包含能够共表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体和表达葡萄糖脱氢酶的第三重组载体；优选的，所述重组工程菌中还包含表达D-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体，或者与表达D-泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的第二重组工程菌联合使用。

5.一种重组工程菌的构建方法，包括下述步骤：

(1)将L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列、酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列、葡萄糖脱氢酶改造基因序列、D-泛解酸内酯水解酶改造基因序列的任一种或其组合分别导入载体，得到重组载体；

(2)将所得重组载体导入宿主细胞，得到重组工程菌。

6.一种重组工程菌的诱导表达方法，包括下述步骤：

S-1，将重组工程菌按照1-5％接种量接种于LB培养基中，将其置于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-16h，获得一级种子液；

S-2，将一级种子液按照1-5％接种量接种于TB培养基中，将其置于25-40℃、50-500rpm条件下培养6-20h，离心，磷酸缓冲液洗涤，收集菌体。

7.一种D-泛解酸内酯的制备方法，包括下述步骤：将浓度为10-300g/L的DL-泛解酸内酯置于存在葡萄糖、重组工程菌OD值为1-5的反应体系中，将其置于30-40℃、pH5-7条件下反应20h-40h，制得D-泛解酸内酯。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述重组工程菌可表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶；优选的，还可加入表达D-泛解酸内酯水解酶的重组工程菌。

9.根据权利要求7-8任一项所述的制备方法，其中，DL-泛解酸内酯：甲酸的摩尔比为1:(0.8-1.2)，优选为1:(0.9-1.1)。

10.权利要求3-4任一项所述的重组工程菌用于制备D-泛解酸内酯中的应用。