[发明专利]一种重组工程菌及其构建方法和其应用

说明书

本发明涉及一种重组工程菌及其构建方法和其应用，所述重组工程菌经诱导后高效表达L‑泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶和D‑泛解酸内酯水解酶，高效转化DL‑泛解酸内酯生成D‑泛解酸内酯。本发明的重组工程菌提高了L‑泛解酸内酯脱氢酶的选择性，显著提高D‑泛解酸内酯的纯度和质量、反应效率和资源利用率，具有操作简便、绿色环保、成本更优等优点。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种重组工程菌及其构建方法和其应用。

背景技术

D-泛解酸内酯为用于合成维生素类药D-泛醇及神经营养药D-高泛酸钙的医药中间体，并用作饲料添加剂和日化产品的合成前体，年产量超过上万吨。

常采用化学合成法制备DL-泛解酸内酯，再将制得的DL-泛解酸内酯转化为D-泛解酸内酯。微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯获得D-泛解酸内酯包括下述步骤：1)微生物酶选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯或者L-泛解酸内酯，得到L-泛解酸内酯和D-泛解酸或L-泛解酸和D-泛解酸内酯；2)利用有机试剂萃取混合液，实现L-泛解酸内酯和D-泛解酸的分离；3)D-泛解酸经过内酯化处理，得到D-泛解酸内酯，L-泛解酸内酯经过化学消旋重新变成DL-泛解酸内酯，再拆分。该方法存在下述缺陷：一是拆分步骤多，分离效率低；二是化学消旋过程会产生大量色素和其它杂质，拆分制得的D-泛解酸内酯颜色较深，外观品质较差；三是化学消旋会产生大量硫酸盐，形成固体废弃物，造成环境污染。

CN110423717A公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成D-泛解酸内酯的方法，该方法通过重组细胞表达L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，来转化D,L-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯、并进而生成D-泛解酸内酯。该方法存在下述缺陷：L-泛解酸内酯脱氢酶对L-泛解酸内酯及其催化反应的选择性差，其既催化L-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，也催化D-泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，L-泛解酸内酯和D-泛解酸内酯同时竞争结合L-泛解酸内酯脱氢酶的活性位点，D-泛解酸内酯会陷入循环反应，由此导致酶活力降低；当底物中L-泛解酸内酯含量较低时，无法和L-泛解酸内酯脱氢酶有效接触，难以完全转化，由此导致制得的产物中会含有L-泛解酸内酯而增加纯化难度，且产品质量难以保证。

为此，如何开发高选择性且利于提高D-泛解酸内酯的纯度和质量、反应效率和资源利用率等重组载体及其工程菌成为本领域迫切需要解决的方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组载体，所述重组载体含有L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D-泛解酸内酯水解酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的重组载体。

本发明的优选技术方案中，L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D-泛解酸内酯水解酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4分别在第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体和第四重组载体上。

本发明的优选技术方案中，所述重组载体任选地包括第五重组载体或第六重组载体的任一种，其中，第五重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第六重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D-泛解酸内酯水解酶改造基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明优选的技术方案中，所述重组载体用于DL-泛解酸内酯制备D-泛解酸内酯。