[发明专利]一种构建高质量免疫组库文库的方法

权利要求书

1.一种构建带有双端Barcode、双端UMI和双端Index的高质量免疫组库文库的方法，其特征在于，所述方法按照以下步骤进行：

(1)提取样本中的总RNA；

(2)对步骤(1)中的总RNA进行逆转录，合成带有单端Barcode和单端UMI的First-strand cDNA，并纯化所述First-strand cDNA；

(3)往所述First-strand cDNA中加入PCR#1反应体系，进行第一轮RCR扩增，经纯化后获得第一轮扩增产物；

(4)往第一轮扩增产物中加入PCR#2反应体系，进行第二轮RCR扩增，经纯化后获得第二轮扩增产物；

(5)往第二轮扩增产物中加入PCR#3反应体系，进行接头序列的扩增，所产生的扩增产物经纯化后即为免疫组库文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，逆转录是在存在带有Barcode、UMI和Read2的特异性引物GSP的情形下进行的，GSP从5’端开始为Read2序列、Barcode序列、UMI序列和BCR或TCR亚型特异性序列，Read2序列长22bp，Barcode为12bp的可变序列和4bp的固定碱基ACTG，UMI由随机碱基组成，长12bp，碱基序列为NNNNNNNNNNNN。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在逆转录后，先进行RNase H处理，然后再进行纯化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，在第一轮RCR扩增时，以所述First-strand cDNA为模板，利用带有Barcode、UMI和Read1的特异性引物进行PCR延伸，从而形成带有双端Barcode和UMI的第一轮扩增产物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，在第二轮RCR扩增时，以带有双端Barcode和UMI的第一轮扩增产物为模板，利用Read1和Read2作为上下游引物进行扩增富集，获得第二轮扩增产物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，在第三轮RCR扩增时，以扩增富集后的第二轮扩增产物为模板，以含有双端Index的测序接头为引物，对富集后的模板进行扩增，从而获得带有测序接头的扩增产物，用于上机测序。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在逆转录时，所述引物序列为SEQ ID No 1(TCR)和SEQ ID No 2-6(BCR)。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在第一轮RCR扩增时，所述引物序列为SEQ IDNo 7-43(TCR)和SEQ ID No 44-51(BCR)。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在第二轮RCR扩增时，所述引物序列为SEQ IDNo 52-53。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在第三轮RCR扩增时，所述引物序列为SEQID No 54-55。

11.一组用于构建带有双端Barcode、双端UMI和双端Index的高质量免疫组库文库的引物，其特征在于，所述一组引物包括SEQ ID No 1-55。

12.一种用于构建带有双端Barcode、双端UMI和双端Index的高质量免疫组库文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一组引物，所述一组引物包括SEQ ID No 1-55。

13.一种高质量免疫组库文库,其特征在于，所述免疫组库文库的两端含有Barcode、UMI和Index。