[发明专利]测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法

权利要求书

1.测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外LPAAT反应；步骤五，LC-MS脂组学测定；其特征在于：

其中在上述步骤一中，将含有35S启动子调控的p19基因的表达载体转入GV3101农杆菌系中，将拟南芥叶片的LPAAT序列和油菜的LPAAT序列的内含子经优化克隆进pJP3343载体，最终将载体导入农杆菌AGL1随同病毒沉默蛋白p19注射进烟草的叶片，待用；

其中在上述步骤二中，首先将含基因表达载体的农杆菌接种于LB培养基，于28℃条件下黑暗培养至生长对数期，然后离心收集菌体，加buffer重悬，于28℃继续培养2h，最后注射到本氏烟草叶片并标记注射范围，光照培养5天后沿标记区域剪下叶片，冻干待用；

其中在上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻干叶片，于研钵中加液氮研磨成粉，加buffer A充分研磨，离心后弃上清，再使用buffer B润洗底部微粒体，并转入匀浆器充分研磨，最后通过液氮极速冷冻，于-80℃保存，待用；

其中在上述步骤四中，反应总体积为100ul，以6nM的LPA作为底物，6nM的乙酰辅酶A为酰基供体，50ul的缓冲液(0.2M、pH＝7的Tris，0.4M的蔗糖，20ug/ul的牛血清蛋白BSA)和15μg步骤三中制备的微粒体进行体外LPAAT反应，将上述4种成分充分混合后，在室温下700rpm震荡培养30min，在反应的0，5，10，15和30min分别取出15μL反应混合物加入1.2mL的氯仿/甲醇(2/1，v/v)和0.3mL的KCl终止反应，再以2500rpm的速度震荡7min，以1700xg离心5min，收集下层脂质相，将收集的脂质溶液的溶剂在氮气下吹干，备用；

其中在上述步骤五中，取LPAAT体外干燥油样，溶解于20μL的叔丁醇和甲醇混合溶液，取2μL进行LC-MS分析。

2.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，其特征在于：所述步骤一中，p19基因为番茄丛矮病病毒沉默抑制子，拟南芥叶片的LPAAT序列为NP_567052，油菜的LPAAT序列为NP_001302955。

3.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，其特征在于：所述步骤二中，LB培养基配方为10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母膏和5g/L的NaCl，pH＝7.0；buffer为5mM的MES、5mM的MgSO₄和100μM的乙酰丁香酮，pH＝5.7。

4.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，其特征在于：所述步骤二中，离心收集菌体是取200μL培养液于10mL培养基中再次培养，然后在4000r/min下离心5min。

5.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，其特征在于：所述步骤三中，buffer A为pH7.2的K₂HPO₄/KH₂PO₄溶液、0.33m蔗糖、0.1％牛血清蛋白和1000U/mL过氧化氢酶；离心条件为：37000r/min，温度为4℃，离心时间为90min；buffer B为pH7.2的K₂HPO₄/KH₂PO₄溶液。

6.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，其特征在于：所述步骤五中，混合溶液中叔丁醇和甲醇的比例为1:1，且混合溶液中含有10mM丁羟甲苯。