[发明专利]用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法

说明书

本申请提供了一种用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法。本发明提供的试剂盒包括微流控芯片、试纸条检测卡盒、复溶液和提取对照品，所述微流控芯片包括至少4个检测通道，所述检测通道内含有扩增引物和扩增试剂，所述试纸条检测卡盒包括微流控芯片卡槽、稀释液槽和至少4个试纸条槽。本申请提供的试剂盒将特异灵敏的PCR技术与方便快速的免疫层析技术进行结合实现对艰难梭菌的检测，具有快速简单准确的特点，试剂便于运输和保存，结果可视化，对人员的专业性要求不高，适合基层医院及现场使用。

技术领域

本申请属于生物技术和医学领域，具体涉及一种用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile，C.difficile)是一种产毒素或非产毒素的厌氧芽孢杆菌，是人类肠道正常菌群之一，其在1978年首次被证实与疾病有关。艰难梭菌感染(CDI)后容易引起腹泻、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、败血性休克甚至死亡。健康成人中的肠道菌群通常可抵抗艰难梭菌定植。然而，一旦正常的肠道菌群发生变化，就丧失了对艰难梭菌定植的防御性。最常见的感染因素是使用抗生素。当由于大量应用广谱抗生素等原因造成肠道正常菌群失调，该菌过度繁殖，就会引起抗菌药物相关性腹泻、艰难梭菌相关性腹泻等，严重时可引起伪膜性肠炎甚至死亡。临床上，约15％～25％的抗菌药物相关性腹泻，50％～75％的抗菌药物相关性结肠炎和95％～100％的伪膜性肠炎是由CDI(艰难梭菌感染) 引起。在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国CDI潜在威胁远高于国际水平。

艰难梭菌的主要毒力因子是肠毒素A和细胞毒素B。多数致病菌株是毒素A 阳性、毒素B阳性(A+B+)的菌株，毒素A阴性、毒素B阳性(A-B+)的变异菌株已被公认为是致病性的。某些艰难梭菌菌株还会产生被称为CDT或二元毒素的肌动蛋白特异性ADP核糖基转移酶。二元毒素决定区含有两种基因(cdtA 和cdtB)，位于致病性决定区PaLoc外部。近数年，出现过属于PCR核糖体分型027、PFGE型NAP1和REA型的B1“剧毒”和氟喹诺酮耐药菌株引起的CDI 爆发。这些菌株由于调控基因tcdC缺失，导致产毒能力增加。随着其发病率和病死率的急剧上升，准确的诊断对于最佳治疗手段和预防措施来说至关重要。

常用实验室检测方法有细胞毒素中和试验、产毒素培养、免疫学方法和核酸扩增法。细胞毒素试验和产毒素培养为诊断CDI的金标准，细胞毒素试验的检测结果受细胞种类的限制，操作复杂，费用高；产毒素培养需耗费大量的时间，对设备以及人员技术要求较高；免疫学方法虽然快速，但灵敏性与特异性并不稳定，且当谷氨酸脱氢酶与毒素A/B结果不一致时还需结合PCR方法进行诊断。核酸扩增技术NAATs通过对毒素基因的保守序列设计特异性引物来检测毒素基因，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域，但其检测过程依赖于昂贵的qPCR仪器，很难满足基层医院以及现场检测的需求。环介导等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)等恒温扩增技术使用的兴起降低了NAATs在检测方面仪器和试剂的费用，但都具有一定的缺点。LAMP产物复杂，很难对产物实施进一步的序列特征等相关的分析，导致后续应用复杂，不太容易进一步实施多重序列的同时分析。RCA依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题，SDA需要经过DNA单链模板的准备、5端3端均含酶切位点的目的DNA片段的生成和链置换反应多个阶段，且需要经修饰的 dNTP作为底物、靶序列准备复杂。