[发明专利]一种基于非甲基化CpG纳米疫苗、制备方法和应用

权利要求书

1.一种基于非甲基化CpG纳米疫苗，其特征在于，该疫苗是非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤CpG的脱氧寡核苷酸ODNs纳米疫苗CpG DNAsome，其含靶向基团–Y型双链CpG ODNs–1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺NGPE，所述的CpG ODNs和靶向基团的摩尔比为1-3:1，所述的CpG ODNs序列如下：

2.根据权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome，其特征在于：所述的纳米疫苗的粒径为200-300nm，形态为球形。

3.根据权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome，其特征在于：所述的靶向基团为具有肿瘤特异性靶向的酶、抗体、适配体或者小分子化合物。

4.根据权利要求3所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome，其特征在于：所述的靶向基团为巨噬细胞特异性适配体。

5.根据权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome，其特征在于：还可含有肿瘤抑制基因、DNA、siRNA或miRNA，所述的CpG ODNs和肿瘤抑制基因、DNA、siRNA或miRNA的质量比为1-3:1。

6.根据权利要求5所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome，其特征在于：所述的肿瘤抑制基因为SirT1 siRNA。

7.一种如权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)一个制备Y型双链CpG DNA(Y-CpG DNA)的步骤：

每个单链CpG ODN分别溶解在退火缓冲液中，与等量的相应CpG ODNs(Y₀₁、Y₀₂、Y₀₃)混合杂交成Y-CpG DNA。

(2)一个制备Y-CpG DNA-靶向基团的步骤：

先将靶向基团活化，再将溶于磷酸盐缓冲液中的Y-CpG DNA加入到被活化的靶向基团溶液中，并在室温下搅拌反应10～30小时后，纯化获得Y-CpG DNA-靶向基团。

(3)一个制备Y-CpG DNA-靶向基团-lipid复合物的步骤。

NGPE溶解在含有辛基糖苷、EDC和NHS的MES缓冲液中，于室温下振荡反应，再将制备好的Y-CpG DNA-靶向基团加入反应混合物中，室温孵育后纯化获得Y-CpGDNA-靶向基团-lipid复合物。

(4)将Y-CpG DNA-靶向基团-lipid复合物自组装形成荷载非甲基化CpG的纳米疫苗CpGDNAsome。

8.根据权利要求7所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome的制备方法，其特征在于：所述的Y-CpG DNA-靶向基团-lipid复合物还可通过杂交和自组装，获得荷载肿瘤抑制基因的纳米疫苗CpG DNAsome。

9.根据权利要求7或8所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome的制备方法，其特征在于：所述的含有肿瘤抑制基因时，制备荷载肿瘤抑制基因的Y型双链CpGDNA即肿瘤抑制基因-Y-CpG DNA的步骤，将等量的单链CpG ODN与荷载肿瘤抑制基因正义链的单链CpG ODN分别溶解在退火缓冲液中，制备荷载肿瘤抑制基因正义链的Y型双链CpG DNA，再将等量的荷载肿瘤抑制基因正义链的Y-CpG DNA与肿瘤抑制基因反义链混合杂交合成荷载肿瘤抑制基因的肿瘤抑制基因-Y-CpG DNA。

10.根据权利要求7、8或9所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG DNAsome的制备方法，其特征在于制备肿瘤抑制基因-Y-CpG DNA-靶向基团的步骤中，先将靶向基团活化，然后将溶于磷酸盐缓冲液中的肿瘤抑制基因-Y-CpG DNA加入到被活化的靶向基团溶液中，并在室温下搅拌反应10～30小时后，纯化获得肿瘤抑制基因-Y-CpG DNA-靶向基团。