[发明专利]基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物、探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR检测用引物和探针的组合物，并建立了岩原鲤的实时荧光PCR检测方法，达到精确鉴定岩原鲤的目的。根据岩原鲤的线粒体DNA中12SrRNA的基因序列设计特异性引物，上游引物YYLF1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物YYLR1核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针YYL‑MGB1：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。只需采集岩原鲤生活的水域水样，既能应用在水体中岩原鲤的定性检测上，特异性高、时效性好；又能定量检测出环境中岩原鲤的密度，有利于反映出岩原鲤在不同样点的生物量及时空动态，从而为长江禁渔大背景下岩原鲤的人工放流效果评价和资源管理保护提供参考。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针及其检测方法。

背景技术

岩原鲤(Procypris rabaudi Tchang)属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，原鲤属(Procypris)，是长江上游及其支流的一种特有鱼类，主要分布于宜昌以上长江水系的干、支流及金沙江中下游的江河中，属上等食用珍贵鱼品。岩原鲤野外资源量自上世纪70年代以来急剧下降，被列为易危物种和濒危鱼类。受限于现在的观察和采样技术，截止目前，关于岩原鲤的保护生物学信息相当有限，对它的分布范围和种群情况尚不清楚。因此建立岩原鲤的快速准确鉴定方法十分必要。环境DNA技术是一种高灵敏度、低成本、无损伤的物种监测新技术，只需要从水环境样品直接提取DNA，就能够快速检测出目标物种。

受到调查人员专业背景和物种本身生物学特性的限制，部分生物类群的生物学信息获取的准确性和信息量很有限，例如岩原鲤大多栖息在底质多岩石的水体底层，这使得调查人员很难察觉，影响鉴定准确率。再加上长江干流2020年起禁止捕捞十年，使得直接监测和评估岩原鲤种群愈发困难。

中国发明专利申请CN 112126693A公开了一种岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法，其运用岩原鲤亲子鉴定用引物组中的20对微卫星引物进行梯度PCR扩增获取基因分型数据，与本专利申请目标和方法不同，无法进行岩原鲤检测。且目前没有岩原鲤环境DNA的实时荧光鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。

本发明针对长江经济鱼类中的岩原鲤进行鉴定区分。受限于现在的观察和采样技术，关于岩原鲤的保护生物学信息相当有限，对它的分布范围和种群情况尚不清楚。且长江鱼类种类繁多，地理分布较近的种类分子水平的差异也较小，这对实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，是本领域的技术难题。因此，本领域亟需解决这一技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耗时短、灵敏度高的基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物。

本发明的另一目的在于提供上述基于环境DNA的岩原鲤的检测方法。

本发明的又一目的在于提供上述基于环境DNA的岩原鲤的检测试剂盒。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增引物的上游引物为YYLF1、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物为YYLR1、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为YYL-MGB1、其核苷酸序列如SEQID No.3所示。

上述一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物的制备方法是根据岩原鲤的线粒体DNA(mtDNA)中12SrRNA基因的序列设计，并建立了岩原鲤环境DNA的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定岩原鲤的目的。