[发明专利]一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matK引物及方法

权利要求书

1.一种适用于杜鹃花属物种鉴定的matK引物，其特征在于，所述引物为一对；

正向引物matK-390F的核苷酸序列(5’-3’)为CGATCTATTCATTCAATATTTC

反向引物matK-Rh_R的核苷酸序列(5’-3’)为GCCCGCTATAATAATGAGAAAGAYTTC。

2.一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取杜鹃花属植物标本的总DNA；

S2、引物PCR扩增得到PCR产物，所述引物为：

matK-390F(5’-3’)(CGATCTATTCATTCAATATTTC)

matK-Rh_R(5’-3’)(GCCCGCTATAATAATGAGAAAGAYTTC)；

S3、检测PCR扩增结果；

S4、将所述PCR产物进行测序；

S5、将DNA序列进行比对调整；

S6、对调整好的序列进行建树并进行聚类分析。

3.根据权利要求2所述的一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，其特征在于，所述步骤S2中，用于测序的PCR扩增总反应体积为25μL，其中包括2×Taq MIX 12.5μL，引物各1.25μL，浓度为(30±1)ng/μL的DNA模板2.5μL，加灭菌的超纯水至25μL；PCR反应程序为，94℃预变性3min，94℃变性30s、54℃退火40s、72℃延伸40s(以上变性、退火、延伸进行34个循环)，72℃延伸10min。

4.根据权利要求2所述的一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

5.根据权利要求2所述的一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，其特征在于，所述步骤S4使用ABI3730测序仪进行Sanger法测序。

6.根据权利要求2所述的一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，其特征在于，所述步骤S5包括以下步骤：

1)DNA序列使用Sequencher 5.3进行序列拼接及校对；

2)将拼接、校对好的序列文件放入MAFFT自动比对；

3)将自动比对后的文件用BioEdit对序列调整修订自动比对的错误；

4)将调整好的序列导入SequenceMatrix中生成nexus、Phylip格式的文件用于建树。

7.根据权利要求2所述的一种适用于杜鹃花属物种鉴定的方法，其特征在于，所述步骤S6包括以下步骤：

1)对调整好的序列进行ILD test，用以检测基因之间是否可联合建树，若P值0.01，进行联合基因建树；

2)利用Paup 4.0b10进行MP运算，Number of replicates为1000，random reps为100；

3)利用MrBayes进行BI运算，设置mcmcp ngen于1 000 000-5 000 000之间，使最终Average standard deviation of split frequencies结果小于0.01；

4)利用CIPRES网站使用RAXML tools计算ML树，核苷酸选择模型GTRCAT，抽样自展1000次；

5)利用MAGA 5.2计算遗传距离，评估各序列特性。