[发明专利]一种果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体、基因工程菌及构建方法和蛋白表达方法

权利要求书

1.一种果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体，其特征在于，包括骨架载体和编码果糖胺脱糖酶的基因；所述编码果糖胺脱糖酶的基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述骨架载体包括pPIC9K。

3.权利要求1或2所述果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体的构建方法，包括以下步骤：

使用双酶切法将编码果糖胺脱糖酶的基因与骨架载体相连接，得到表达载体。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述双酶切法，每40～60μL的双酶切体系包括：10×quitcutbuffer 4～6μL、pPIC9K或含编码果糖胺脱糖酶的基因的核酸28～32μL，4～6U/μL的SnaBI和NotI各0.8～1.5μL和余量的水。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述双酶切法的双酶切条件为36～38℃，1～3h。

6.一种含权利要求1或2所述表达载体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌包括毕赤酵母。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

8.权利要求6或7所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

将果糖胺脱糖酶毕赤酵母表达载体线性化，电转化毕赤酵母的感受态细胞，得到基因工程菌。

9.基于权利要求6或7所述基因工程菌的果糖胺脱糖酶表达方法，包括以下步骤：

将所述基因工程菌接种到BMGY液体培养基中，进行第一振荡培养至OD₆₀₀在2～6之间，离心，弃上清，得到培养菌体；

用BMGY液体培养基重悬所述培养菌体，在100～300r/min进行第二振荡培养84～108h；所述第二振荡培养的期间，每10～14h向培养基中加甲醇至甲醇的终体积百分含量为0.5％～1.0％。

10.根据权利要求9所述的表达方法，其特征在于，所述甲醇为100％的甲醇或甲醇的体积百分含量为80％以上的甲醇水溶液。