[发明专利]一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法。该DNA生物传感器至少包括四面体DNA纳米结构和含柔性铰链的DNA传感结构，含柔性铰链的DNA传感结构包括带有FRET供体和FRET受体的核苷酸链，核苷酸链与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列发生链杂交反应，或者核苷酸链与SEQ ID NO:1～2及SEQ IDNO:4任一核苷酸序列的延长链的3’端发生链杂交反应，即得DNA生物传感器。该DNA生物传感器对细胞内拥挤环境产生非特异性力敏感，可用于细胞内大分子拥挤情况的直接测定，将DNA生物传感器用于多种细胞的分类研究中，达到了90％的分类准确率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法。

背景技术

细胞作为生物体结构和功能的基本单位，其胞内充满着大量的核酸、蛋白质、多糖、脂质等生物大分子，胞内生物大分子含量会随着细胞种类乃至分型的不同而有所差异。总体而言，胞内生物大分子总量约占细胞总容积的20％～30％，因此胞内是一个十分拥挤的环境。源于排除体积的拥挤理论分析表明：拥挤环境对细胞内生化反应的动力学和热力学有很大影响。拥挤环境作为细胞内重要的生理因素，不容忽视，且已经证明很多疾病的发生与大分子拥挤之间存在着某种相关性。例如，癌细胞中的游离水的数量少于正常细胞，导致细胞内拥挤环境不同，这种差异与癌细胞恶性增殖及侵袭转移等多种疾病的发生相关；此外，拥挤环境能够影响细胞内蛋白质的反应平衡，蛋白质的折叠，病理蛋白质的聚集等，如拥挤环境能够促进原纤维化，而帕金森病和阿尔兹海默症等都与人类淀粉样蛋白的原纤维化相关。

近年来的研究显示，当受到低渗或高渗压力干扰时，细胞膜内外渗透压出现差异，细胞可以诱导细胞体积恢复系统，通过失水或者吸水调节体积减少(RVD)或者增加(RVI)，进而细胞内的大分子拥挤情况发生变化，且响应渗透刺激变化程度与细胞的种类相关。因此可以通过各种各样的生物传感器来检测大分子拥挤这一变化因素，从而实现对不同细胞的区分，这对生物医学特别是肿瘤治疗领域具有重大意义。

目前用于研究细胞内大分子拥挤的传感器包括以下三类：(1)小分子探针，(2)荧光蛋白传感器，(3)DNA分子传感器，但这些研究方法具有一定的局限性。例如小分子探针，一些小分子物质(荧光染料等)易于穿透细胞膜，且无明显的细胞毒性，被广泛用于细胞内大分子拥挤环境的检测，但该类检测方法通过小分子与蛋白质等物质结合，通过蛋白质等的扩散速率估算细胞内的拥挤程度，因此不能实现定量检测；荧光蛋白生物传感器，由于其具有良好的生物相容性，且易于表达的特性被广泛运用于大分子拥挤环境的检测，但该类方法存在蛋白质设计和合成复杂，表达时间周期较长的问题；DNA分子传感器，在转运至细胞内的方法上存在一定的缺陷(转染剂的细胞毒性较大，显微注射方法的操作复杂)，故应用受到限制。因此，开发一种简单、高效、低成本且能够直接定量检测活细胞内拥挤环境的生物传感器具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法。本发明中四面体纳米DNA纳米结构具有可拓展性，当四面体纳米DNA纳米结构与DNA传感结构发生链杂交后，获得的DNA生物传感器可以实现多样本的检测；在拥挤环境产生的非特异性力作用下，由于FRET供体和FRET受体之间的空间距离的可调控性，从而发生FRET效应，使得DNA生物传感器对细胞内拥挤环境产生的非特异性力敏感，可用于细胞内大分子拥挤情况的直接测定；将DNA生物传感器用于多种细胞的分类研究中，达到了90％的分类准确率，将为解析相关疾病与细胞内拥挤环境的发病机制提供了一种全新的方法论。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：