[发明专利]一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞

权利要求书

1.一种CAR-iNKT细胞，所述CAR-iNKT细胞的CAR由抗CD19的特异性抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域组成；

所述抗CD19的特异性抗体的构成是Y-linker-X，所述X的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Y的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，

所述铰链区是CD8α铰链区，所述跨膜结构域是CD8α跨膜结构域，所述共刺激结构域是CD137胞内结构域，所述胞内信号传导结构域是CD3ζ胞内信号传导结构域，

所述由抗CD19的特异性抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域组成的CAR的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.权利要求1所述的CAR-iNKT细胞，其特征在于，所述CAR上还连接有T2A和IL-15，所述IL-15的氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

3.权利要求1所述的CAR-iNKT细胞，其特征在于，所述CAR-iNKT细胞的CAR还与lgG6信号肽相连接。

4.一种制备权利要求1所述的CAR-iNKT细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述CAR的核酸分子所在的载体引入iNKT细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引入包括将载体通过物理方法、化学方法或生物学方法转移入iNKT细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物学方法包括使用病毒载体转染。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒是MSCV逆病毒。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括诱导iNKT细胞的步骤和扩增iNKT细胞的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导iNKT细胞的步骤包括使用优化的淋巴细胞培养基培养样品的步骤，所述优化的淋巴细胞培养基是向基础淋巴细胞培养基中添加α-半乳糖基神经酰胺和细胞因子配制而成，所述细胞因子是商品化的IL-2、IL-21、IL-4和GM-CSF的组合，

所述α-半乳糖基神经酰胺的终浓度是100ng/mL，所述IL-2的终浓度是50U/mL，所述IL-21的终浓度是10ng/mL，所述GM-CSF的浓度是500U/mL，所述IL-4的终浓度是500U/mL；

所述基础淋巴细胞培养基是含有5% FCS的X-VIVO 15培养基。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述iNKT来源于外周血。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增iNKT细胞的方法包括使用含有IL-7和IL-15的淋巴细胞培养基培养包含iNKT细胞的细胞液，然后将细胞接种到抗体液包被的孔板上培养，

所述IL-7的工作浓度是10ng/mL，所述IL-15的工作浓度是5ng/mL。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞培养基的基础淋巴细胞培养基是含有5% FCS的X-VIVO 15培养基。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述包含iNKT细胞的细胞液是磁珠分选得到的，所述抗体液含有CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述磁珠分选中磁珠选用的是Anti-iNKTMicroBeads。