[发明专利]一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法

说明书

本发明涉及植物细胞分离技术，旨在提供一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法。包括：将不包含叶脉且撕去表皮的叶片剩余部分切成小块，浸没于酶液中进行酶解，过滤酶液收集滤液；取蔗糖溶液置于试管中，沿管壁添加Percoll溶液并形成明显分层；将步骤滤液添加至上层后离心处理，缓慢取出保持分层；最上层的无色溶液层，即为表皮细胞所在层。本发明利用梯度分离方法能够快速获得纯净的表皮细胞，避免了去除细胞碎片等杂质的操作。因而操作过程简单，能大大提升植物表皮细胞原生质体的制备效率。无需使用价格高昂的带水平转子的离心机，只需要带角转子的离心机就可以实现表皮和叶肉原生质体的分离。

技术领域

本发明属于植物细胞分离技术，尤其涉及植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法。

背景技术

目前植物叶片表皮原生质体的分离方法，一般是将叶片切成小段或撕去下表皮后，连带着叶肉一起酶解。但是，拟南芥、烟草、番茄等植物的叶片中叶肉细胞占绝大部分，需要根据表皮细胞原生质体相比于叶肉细胞原生质体重量轻的特点，采用密度梯度离心的方法分离叶肉和表皮细胞。但由于存在部分细胞碎片等杂质的原因，容易造成表皮细胞原生质体获取不纯的问题。同时在常规梯度离心时对于离心机的转子类型具有较高的要求，需要带水平转子的离心机。但由于设备价格差别，目前普通的植物研究实验室大多只配备带角转子的离心机。因此，在采用常规分离方法和角转子离心机分离表皮和叶肉原生质体时，会使大部分细胞先离心堆叠至管壁上，原生质体挤压破损，导致大量表皮原生质体丢失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法，包括以下步骤：

(1)取植物叶片，顺着叶脉撕去叶片下表皮，将不包含叶脉且撕去表皮的叶片剩余部分切成小块；

(2)将小块叶片全部浸没于酶液中，在恒温摇床中进行酶解；控制酶解条件为：25～27℃、60rpm/min，1.5～2h；酶解完成后，吹打酶液使粘黏的表皮细胞分离；过滤酶液，收集滤液；

(3)构建梯度分离液：取适量2.5M/L的蔗糖溶液置于试管中，沿管壁添加60％的Percoll溶液并形成明显分层；

(4)将步骤(2)中的滤液添加至步骤(3)中梯度分离液的上层，将试管置于离心机中离心处理；离心完成后缓慢取出，不能剧烈晃动，保持试管中的明显分层；其中最上层的无色溶液层，即为表皮细胞所在层；

(5)取表皮细胞所在层的适量液体，置于显微镜下观察表皮细胞情况；如仍存在少量叶肉原生质体或碎片，则重复步骤(4)的操作。

本发明中，所述步骤(1)中的植物叶片是幼嫩叶片或成熟叶片。

本发明中，所述步骤(2)中，酶液的配置过程如下：称取0.011g 2-吗啉乙磺酸一水合物(MES)溶于10ml去离子水中，以1M/L KOH调pH至5.7；然后加入0.855g蔗糖、0.2g纤维素酶、0.02g果胶酶和0.1g离析酶，混匀溶解，得到酶液。

本发明中，所述步骤(3)中，60％Percoll溶液的配置过程如下：称取0.0044g 2-吗啉乙磺酸一水合物(MES)溶于4ml去离子水中，以1M/L KOH调pH至5.7；加入0.342g蔗糖，混匀溶解；再加入6ml Percoll混悬液混匀，得到60％Percoll溶液。

本发明中，所述步骤(4)中，离心处理的条件为：1000g，5～10min。

本发明中，在添加Percoll溶液和滤液时，使用巴斯德滴管或移液枪沿管壁添加，控制添加速度以保证形成分层。

发明原理描述：