[发明专利]毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用

说明书

本发明公开了毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用。PeAPX4基因及其编码蛋白质的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明首次从毛竹中克隆得到PeAPX4基因并通过在拟南芥中过表达该基因验证了其生物学功能。PeAPX4基因具有调控植物抗逆性的功能，能够为毛竹转基因研究提供有力支持，为毛竹分子育种提供有价值的候选基因。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用。

背景技术

毛竹(Phyllostachys edulis)是禾本科(Gramminales)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys)散生竹种。毛竹具有成材快，可再生等多种优势，更在生物能源开发，防治水土流失等方面具有巨大潜力。在影响毛竹生长的诸多因素中，水分是对其正常生长发育影响最大的因素之一。近年来，受全球气候变暖的影响，毛竹的主要生长地年降水量逐年减少，干旱问题频发，大大影响了竹子的生长状况，也降低了毛竹的经济收益。在南竹北移工作中，最难克服的也是引种地降水少，土地盐碱度高的问题。因此，进行毛竹的竹种改良，培育抗早、抗盐性强的毛竹新品种非常必要。研究逆境条件下毛竹体内相关基因的功能则是进行新品种培育的分子基础工作，对于揭示竹子的抗逆分子机制，进而突破常规育种的局限性，加快竹子育种进程具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

毛竹PeAPX4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用如下方法克隆得到PeAPX4基因：

⑴以毛竹叶和根为材料提取总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。本发明中，可以采用本领域常用的提取细胞总RNA的方法进行毛竹总RNA的提取，例如Trizol法。

⑵将提取得到的毛竹总RNA反转录合成cDNA。本发明中，可以采用本领域常规的cDNA合成方法，例如可采用Promega公司的cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成。

(3)在得到cDNA之后，进行PeAPX4基因的PCR扩增，得到目的片段。

本发明中，PeAPX4基因PCR扩增的体系优选为：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mMdNTP Mix 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA模板2.0μL，LA Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH₂O 11.8μL。PCR扩增反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸53s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

用Oligo7软件设计引物扩增PeAPX4基因。引物序列如下：

上游引物：5′-ATGGCGGCTCCGGTGGTGG-3′

下游引物：5′-TTACTTGCTCCTCTTGGAAG-3′

⑷PCR扩增得到目的片段后，对目的片段进行测序，得到PeAPX4基因。在PCR扩增后对目的片段进行纯化，对于纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。

⑸纯化完成后，将纯化后的目的片段连接到pGEM-T Easy载体，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证为阳性克隆后进行测序。