[发明专利]一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用

说明书

一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用，通过PCR获得来自真菌Aspergillus fumigatusAf293的天冬氨酸蛋白酶基因Af293，并将Af293构建到pPIC9γ质粒上，得到重组质粒Pic9γ‑Af293，并转化到毕赤酵母GS115，获得重组基因工程菌。利用该基因工程菌表达的重组天冬氨酸蛋白酶在pH 4.0‑5.0和温度45‑55℃时稳定，比活为8408.9±305.6 U/mg。在水解蚕蛹蛋白应用中，重组天冬氨酸蛋白酶显示出优异水解潜能，在水解6小时后，水解度提高了50±6.1％，溶解度提高了80％，重组天冬氨酸蛋白酶的稳定特性和水解性能增强了其在工业应用中的潜在能力，特别是在食品和饲料工业中。

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用。

背景技术

天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)是一类重要的蛋白水解酶，其特征在于其活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成(Coates L et al.2001.Biochemistry,40(44):13149-13157.)。大多数天冬氨酸蛋白在酸性pH条件下具有活性，又被称为酸性蛋白酶。基于它们特殊的催化性能，在制药，食品饮料以及饲料工业具有重要的应用价值。

天冬氨酸蛋白酶的主要来源是微生物，已报道的产天冬氨酸蛋白酶的菌株主要有曲霉属的黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、青霉、根霉等以及它们的变异株、突变株等。商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株。专利CN111593036A公布了一种黑曲霉来源的酸性蛋白酶制剂，其酶活可达120U/mg，专利CN107338234B公布了一种米黑根毛霉来源的酸性蛋白酶，其最高产蛋白酶活力为529U/mg。

综上所述，目前产天冬氨酸蛋白酶的菌株多为通过自然诱变结合大规模筛选得到的，其表达量较少，效率较低，且真菌的表面粘附特性导致了大规模生产和培养中的极大困难，这限制了天冬氨酸蛋白酶的生产，因此需要新表达系统。而重组技术，例如异源表达的克隆，具有克服这一障碍的潜力(Yegin S et al.2012.Food Chem,133(4):1312-1319.)。专利CN109679940A公布了一种天冬氨酸蛋白酶异源表达的方法，其酶活达2086.7U/mg，远高于同类报道的酸性蛋白酶酶活。近年来，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经最大化了酸性蛋白酶的基因的异源表达系统敏感性并实现了广泛利用，被认为是优异的表达系统(Yue X et al.2019,35(3):415-424.)。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌及其应用，所述天冬氨酸蛋白酶来自一真菌Aspergillus fumigatus Af293，将天冬氨酸蛋白酶编码基因Af293克隆并构建重组表达载体后，在毕赤酵母GS115中进行表达，获得毕赤酵母工程菌株。

技术方案：一种生产重组天冬氨酸蛋白酶的工程菌，所述工程菌包含SEQ ID NO.1所示天冬氨酸蛋白酶编码基因。

一种重组载体，在表达载体PIC9γ中插入SEQ ID NO.1所示的基因所得。

一种重组菌株，在宿主细胞毕赤酵母GS115中表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酶。