[发明专利]一种丹膝颗粒的指纹图谱的建立方法

权利要求书

1.一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

精密称取没食子酸、栀子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹参酮ⅡA对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液1；精密称取丹参素、芍药苷、人参皂苷Ro、橙黄决明素对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液2；

(2)供试品溶液的制备：

取丹膝颗粒，研细，取粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇，超声提取40-50分钟，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)HPLC-DAD-ELSD串联检测：

分别吸取步骤(1)(2)所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，DAD和ELSD双通道串联测定，记录色谱图；其中，色谱条件为：C₁₈反相色谱柱，流动相A：乙腈，流动相B为0.05-0.1％甲酸水溶液；流速：0.8-1.0mL/min，柱温30-35℃，进样量10μl，分析时间135min，DAD 240-260nm检测；ELSD条件：漂移管温度40-55℃，气体流量1.5L/min，增益8-10；采用下述梯度洗脱方式洗脱：

(4)HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立

吸取步骤(1)(2)所得的对照品溶液和制剂供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法，DAD和ELSD双通道串联测定，记录色谱图；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，建立双通道指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)对照品溶液的制备方法为：

精密称取没食子酸、栀子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹参酮ⅡA对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.015mg/ml的对照品溶液1；精密称取丹参素、芍药苷、人参皂苷Ro、橙黄决明素对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.10mg/ml、0.015mg/ml、0.015mg/ml、0.015mg/ml的对照品溶液2。

3.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)供试品溶液的制备方法为：

取丹膝颗粒，研细，取粉末约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，称定重量，超声提取(功率250W，频率40kHz)45分钟，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

4.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中的色谱柱为CAPCELL PAK C₁₈MGⅡ色谱柱，色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。

5.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中流动相B为0.05％甲酸溶液，总流速为0.8ml/min，柱温35℃。

6.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中DAD下检测波长为254nm，再串联蒸发光检测(ELSD)，漂移管温度45℃。

7.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述丹膝颗粒指纹图谱中共标志出17个共有峰，DAD下共标示10个峰，1号峰为没食子酸、2号峰为栀子苷、3号峰为丹酚酸B、4号峰为淫羊藿苷、5号峰为丹皮酚、9号峰为丹参酮ⅡA；ELSD下标示7个峰，1号峰为丹参素，3号峰为芍药苷，6号峰为人参皂苷Ro，7号峰为橙黄决明素。

8.根据权利要求1所述的一种丹膝颗粒的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

精密称取没食子酸、栀子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹参酮ⅡA对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.015mg/ml的对照品溶液1；精密称取丹参素、芍药苷、人参皂苷Ro、橙黄决明素对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.10mg/ml、0.015mg/ml、0.015mg/ml、0.015mg/ml的对照品溶液2；

(2)供试品溶液的制备：

取丹膝颗粒，研细，取粉末约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，称定重量，超声提取(功率250W，频率40kHz)45分钟，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；(3)HPLC-DAD-ELSD串联检测：

分别吸取步骤(1)(2)所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，DAD和ELSD双通道串联测定，记录色谱图；其中，色谱条件为：CAPCELL PAK C₁₈ MGⅡ色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，流动相：乙腈(A)-0.05％甲酸水溶液(B)；流速：0.8mL/min；柱温35℃，进样量10μl，分析时间135min，DAD 254nm检测；ELSD条件：漂移管温度45℃，气体流量1.5L/min，增益9；采用下述梯度洗脱方式洗脱：

(4)HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的建立

吸取步骤(1)(2)所得的对照品溶液和制剂供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法，DAD和ELSD双通道串联测定，记录色谱图；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，建立双通道指纹图谱；所述指纹图谱共标示出17个共有峰；DAD(254nm)下共标示10个峰，1号峰为没食子酸(保留时间为8.672min)、2号峰为栀子苷(保留时间为30.072min)、3号峰为丹酚酸B(保留时间为61.214min)、4号峰为淫羊藿苷(保留时间为71.975min)、5号峰为丹皮酚(保留时间为79.625min)、9号峰为丹参酮ⅡA(保留时间为116.740min)，ELSD下标示7个峰，1号峰为丹参素(保留时间为13.261min)，3号峰为芍药苷(保留时间为36.343min)，6号峰为人参皂苷Ro(保留时间为81.188min)，7号峰为橙黄决明素(保留时间为84.741min)。