[发明专利]口腔中幽门螺杆菌耐药性分型检测的方法和试剂盒

说明书

由于胃活检样本内窥镜取样困难、成本高，幽门螺杆菌(Hp)生长条件苛刻难以培养，Hp耐药性的侵入性诊断方法并不理想。本发明提供一种非侵入性幽门螺杆菌耐药性检测的分子诊断方法，采用巢氏PCR技术结合测序技术对粪便样本进行快速检测与解析，利用核苷酸序列如表2及表3所示的引物联合检测23SrRNA，gyrA,PBP1,16SrRNA,porD,oorD，rpoB等7种耐药基因的52个位点的突变及rdxA耐药基因的随机突变，进而对目前临床常用7种抗生素耐药情况进行判定。本发明属于生物技术领域，快速灵敏，适合临床应用，在指导幽门螺杆菌患者的个性化诊疗根除方面有较大应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测口腔中幽门螺杆菌耐药性的诊断方法及试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(H.pylori，Hp)是革兰氏阴性螺旋微需氧菌，宿主主要是人类，人体胃幽门是H.p特定的定居部位，其在全球约50-70％的人口的胃上皮中定植，在发展中国家感染率已达到90％，并且存在一定的地理差异。Hp也是目前所知的唯一一种能在人胃中生存的微生物,被认为是导致慢性胃炎，消化性溃疡，胃癌的主要诱因。

1983年，由Marshall和Warren在胃活检中发现Hp并成功培养。1989年，Krajedn从口腔唾液和牙菌斑生物膜中首次成功分离出Hp。1993年，Ferguson等从胃炎患者唾液中培养出活性Hp，从此口腔作为Hp的第二个宿主部位引起人们的关注。口腔Hp可以伴随口腔中的食物和唾液经消化系统的吞咽过程进入胃内，反之，胃内Hp可通过反酸与食物返流的方式流入到消化道后进入口腔。后来经证实，口腔Hp和胃内Hp具有较高的同源性。研究发现慢性萎缩性胃炎(CAG)患者的口腔中Hp的检出率要高于浅表性胃炎和消化性溃疡(PU)患者，胃中Hp感染和口腔Hp检出存在着一定的联系。Hp根除后的二次感染也与口腔Hp存在着一定的相关性。因此，唾液和牙菌斑可作为诊断Hp感染相关诊断的可靠非侵入性检查标本。综上所述，根除口腔中的Hp也是防止胃内Hp再感染的一项重要措施，检测口腔Hp 抗生素耐药性在临床上有非常重要的意义。

目前幽门螺杆菌的根除治疗方案主要包括质子泵抑制剂(PPI)和胃黏膜保护剂以及一种或两种抗生素，可进行三联或四联治疗，然而，在一些地区，标准三联或四联疗法根除率已低于《马斯特里赫特条约》(MaastrichtConsensus)的80％，Hp对一线抗生素的耐药率(包括多重耐药率)呈逐年上升趋势，目前抗生素耐药性已成为成功根除幽门螺杆菌的关键。用于根除幽门螺杆菌的抗生素包括克拉霉素(CAM)，左氧氟沙星(LVX)，阿莫西林(AMX)，四环素 (TET)，利福平(RIF)，呋喃唑酮(FUR)和甲硝唑(MTZ)等。

目前已有单一或多种抗生素耐药性的检测方法，但是临床常用的仍为药敏实验，即侵入性获取胃活检组织，分离培养Hp，由于胃中Hp分布不均匀，患者依从性差，从而导致Hp含量少，培养成功率低。并因Hp培养条件苛刻，生长缓慢，培养周期长等因素而不适用于临床耐药性快速诊断与即时用药指导。综上，目前临床上亟需一种取样简便的可靠的非侵入性Hp 耐药性诊断方法。

本发明提出一种以口腔内唾液及牙菌斑为标本，非侵入性检测幽门螺杆菌7种抗生素耐药性的分子诊断方法及试剂盒，具体方法基于巢氏PCR技术与测序技术，其敏感性、特异性和检测准确率较高，可科学、安全、快速、准确地指导幽门螺杆菌感染患者用药。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种准确、快速、检测流程简单的高灵敏分子诊断方法，可以同时检测目前幽门螺杆菌7种耐药基因，能够更加科学、安全、快速、准确地指导幽门螺杆菌感染患者用药。

一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的诊断方法，其特征在于，标本来源为患者口腔中唾液及牙菌斑，为非侵入性检测。

进一步，由于口腔中种幽门螺杆菌含量少，该诊断方法采用灵敏度更高的巢氏PCR技术进行检测。