[发明专利]一种诱导鸡的胚胎干细胞自噬的方法

说明书

一种诱导鸡的胚胎干细胞自噬的方法，属于生物技术领域。首先通过EdU检测添加了不同浓度雷帕霉素的细胞的增殖能力，其次荧光定量PCR检测自噬相关基因的表达量，最后蛋白免疫印迹检测LC3蛋白的表达量，结合雷帕霉素对细胞增殖效率的影响和诱导自噬发生的效果综合评价从而确定最佳诱导浓度和时间。探讨雷帕霉素对家禽生殖细胞的诱导条件将为自噬在胚胎干细胞向原始生殖细胞的诱导分化中的作用研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及雷帕霉素诱导鸡胚胎干细胞自噬的最佳浓度和时间的方法，具体是一种诱导鸡的胚胎干细胞自噬的方法，属于生物技术领域。

背景技术

雷帕霉素(mammaliantarget of rapamycin, mTOR)是自噬的负调控分子，最早从链霉菌代谢物中提取出来，作为抗真菌药和免疫抑制剂应用于临床，后来发现其有启动自噬途径和抗肿瘤作用。启动自噬的基本原理是雷帕霉素可以进入哺乳动物细胞内与FKBP12受体形成复合物，而这个复合物对mTORC1中的受体特别敏感，可以与 mTORC1结合并抑制其活性，进而使ULK1激活，启动自噬途径。

自噬是一种广泛存在于真核生物中的生命现象。大量研究表明，自噬在细胞和生物体的发育和分化过程中均起到非常重要的作用。如在人白血病HL-60细胞中添加雷帕霉素，结果表明1、2、3和5μmol/L雷帕霉素对HL-60细胞增殖均有抑制作用，且抑制效率随着浓度升高而升高。用2μumol/L雷帕霉素处理HL-60细胞0、12和24h后，细胞浆内自噬小体数量增多，形态典型特异，且胞浆内有大的空泡出现，这说明雷帕霉素能够诱导HL-60细胞发生自噬。

发明内容

目前已有研究报道雷帕霉素在小鼠、人等多个物种中的诱导浓度和诱导时间，但对家禽生殖细胞诱导的条件仍不清楚。有研究表明在不同的细胞中，雷帕霉素的作用效果不同。如在人白血病HL-60细胞中，1、2、3和5 umol/L雷帕霉素对HL-60细胞增殖均有抑制作用，且抑制效率随着浓度升高而升高。而在骨髓间充质干细胞中添加1、5、10、20、50、 100nM雷帕霉素分别处理12、24、36、48h后小鼠BMSCs增殖率呈先升高后下降的变化趋势，且均于24h细胞增殖率达到峰值。目前雷帕霉素对家禽生殖细胞诱导自噬的条件及其对细胞增殖效率的影响尚未可知。

本发明的技术方案如下：

首先通过EdU检测添加了不同浓度雷帕霉素的细胞的增殖能力，其次荧光定量PCR检测自噬相关基因的表达量，最后蛋白免疫印迹检测LC3蛋白的表达量，结合雷帕霉素对细胞增殖效率的影响和诱导自噬发生的效果综合评价从而确定最佳诱导浓度和时间。

本发明的有益效果如下：

本发明操作简单，切实可行。发明人前期对鸡的胚胎干细胞向原始生殖细胞诱导过程中测序发现自噬信号通路被激活，自噬相关基因INS、VAC8、ATG7、ATG8表达上调，AMPK、ATG4表达下调。这启发探讨自噬在原始生殖细胞诱导分化中的作用。而探讨雷帕霉素对家禽生殖细胞的诱导条件将为自噬在胚胎干细胞向原始生殖细胞的诱导分化中的作用研究奠定基础。发明人具备成熟的分离生殖细胞的技术，具有该发明所需具备的设备及研究基础。该发明将为后续研究自噬在PGC形成过程中的功能机制研究奠定基础，同时也为家禽细胞和胚胎工程研究提供更多的实验材料。

具体实施方式

不同浓度及诱导时间的雷帕霉素对胚胎干细胞增殖的影响