[发明专利]一种流产衣原体的细胞培养方法及应用

说明书

本发明涉及一种流产衣原体的细胞培养方法及应用。本发明所述培养方法，包括以下步骤：将长成单层的细胞进行洗涤，得到洗涤后的细胞；将流产衣原体接种液接种与DNA转染试剂Lipofectamine 2000混合，静置，接种到洗涤后的细胞上，孵育，吸弃孵育后液体，使用培养液培养48～72h。本发明所述培养方法不需进行离心操作，能够实现流产衣原体对体外培养细胞的高效感染，操作便捷。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种流产衣原体的细胞培养方法及应用。

背景技术

衣原体(Chlamydia spp.)是一类革兰氏阴性、专性细胞内寄生、具有独特的双相发育周期的原核微生物，可感染人和多种动物并引起疾病，是一类重要的病原微生物。所有衣原体物种均具有相同的生活周期，包括感染和在细胞内增殖2个阶段。衣原体的原体(elementarybodies，EBs)代谢不活跃但具有感染性。游离的EBs附着在宿主细胞表面后，通过胞吞作用进入细胞并形成包涵体(inclusion)，在包涵体内EBs转变为代谢旺盛的网状体(reticulatebodies，RBs)，RBs通过二分裂的方式增殖。经过一定时间的增殖，RBs重新转变为EBs并释放到细胞外完成其发育周期。

流产衣原体(Chlamydia abortus)是绵羊地方性流产(ovine enzooticabortion，OEA)的主要病原，能够引起感染母羊在妊娠期最后2～3周内出现流产、死产羔羊或足月产下不能存活超过48小时的虚弱羔羊。衣原体感染引起的妊娠晚期流产在世界许多养羊地区，特别是在临产期羊群密集的地区造成严重的经济损失。除绵羊外，流产衣原体感染的山羊、牛、猪、马等家畜同样引起妊娠晚期流产。流产衣原体也能感染人，引起非典型肺炎和孕妇流产等，属于人兽共患病病原。及时的免疫接种是防控动物流产衣原体病最有效的措施。

流产衣原体也可在鸡胚中大量繁殖，从而收获抗原用于疫苗的制备，由中国农业科学院兰州兽医研究所开发的奶牛衣原体病灭活疫苗即是通过鸡胚来增殖抗原的。流产衣原体也可用体外培养的小鼠成纤维细胞(McCoy，L929)、绿猴肾细胞(BGM)、小仓鼠肾细胞(BHK)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa)等多种细胞系进行分离和增殖培养。利用培养的细胞从临床样本中分离流产衣原体菌株比使用鸡胚分离，操作更便捷，而且敏感更高，目前广泛使用。然而，由于包括流产衣原体在内的多种衣原体病原，其自发感染体外培养细胞的能力较弱，利用体外培养的细胞分离或增殖流产衣原体，常需要对细胞进行适当的处理，以增强对衣原体的易感性。目前常用的方法是，以30μg/mL的DEAD-D预处理细胞15min以中和细胞表面电荷，再将衣原体接种液与细胞一起以1500g的离心力离心1h，最后更换成含环己酰亚胺的培养液，这样才能够对衣原体进行有效培养。这种培养方法，尽管效果较好，但步骤繁琐，不适用于抗原的大规模生产。鸡胚虽然可以用于大规模生产抗原，但生产工艺过于复杂，而且鸡胚算是活的生物，存在一定的伦理争议，不符合现代疫苗生产工艺的发展理念和趋势。因此，突破衣原体需要通过离心辅助才能有效感染体外培养细胞的技术瓶颈，成为利用细胞培养实现规模化生产衣原体抗原的必由之路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流产衣原体的细胞培养方法及应用。本发明所述培养方法不需进行离心操作，能够实现流产衣原体对体外培养细胞的高效感染，操作便捷。

本发明提供了一种流产衣原体的细胞培养方法，包括以下步骤：

将长成单层的待感染细胞进行洗涤，得到洗涤后的细胞；

将流产衣原体接种液与DNA转染试剂Lipofectamine 2000混合，静置，接种到洗涤后的细胞上，孵育，吸弃孵育后液体，得到感染后的细胞；

感染后的细胞使用培养液继续培养48～72h。

优选的是，所述待感染细胞包括小鼠成纤维细胞McCoy、小鼠成纤维细胞L929，小仓鼠肾细胞BHK-21或人宫颈癌细胞HeLa。